生物PCR检测

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MEMS生物芯片技术

——PCR芯片技术

勾海波 22011325

近年来, 科学家们在微机电系统(MEMS) 、纳米技术和分子生物学领域取得了无可争议的进步和突破, 将这些技术结合起来形成功能更强大的分析系统成为目前人们科学探索的目标。生物MEMS(BIOMEMS) 将MEMS 技术应用在生物、医学领域,研究适合于生物领域的微器件和微制造系统, 是最具吸引力的。特别是在寻找新基因、DNA 测序、疾病诊断、药物筛选等方面, 是最有应用前途的研究方向。

BIOMEMS 的研究内容主要包括在生物体外进行生物医学诊断的微系统和在生物体内进行生物医学治疗的微系统。微机械制造技术使BIOMEMS 具有微米量级的特征尺寸, 得以实现器件和系统的微型化, 使生物医学的诊断和治疗可以快速、自动化、高通量、较小损伤地完成。BIOMEMS 技术批量生产能力更极大地降低了生物医学诊断和治疗的成本, 因此BIOMEMS 技术已成为21 世纪科学研究和商品化的主要研究目标。

生物微机电系统( BIOMEMS) 是在生物医学工程中使用的MEMS, 其中最典型的就是生物芯片。由尺度效应可以知道,MEMS

标题： 分子生物组检测程序性能验证标准操作程序

Logo/×××××医院检 科验

××× laboratory/lab

文件编号 :HBHTCM/LH-SOP-PCR- ×× 版本号：× 修改号： 0

生效日期：×××× -×× -××发行部门： PCR 组 编制人：×××审核人：××× 批准人：×××页码：第 1页/共 4 页

1 目的

确立分子生物组检测程序性能验证标准操作规程，使检测程序性能证验操作规范化。

2 适用范围

采用基因扩增检验方法测检的所有目。 项

3职任人 或责

3.1组长负责组工作人员本织具体实施，并审核报告； 3.2 3.3

本组工作人员负责对适用范内的检围测程序行验进证操作，并撰写报告； 技术主管负责监督本规程的实施；

3.4质量主管参与对检验程序有效性的评价及指导； 3.5检验科主任责负批准测检程序的施。 实4

内容

定量检测方法和程序的分析性能验证内容至少包括精密度、正确度、线应性、测 量和 /或可报告范围、抗干扰能力等。定性检测项目验证内容至少包括测应定下限、特 异性、准确度（方法学比较或与金标准比较） 4.1

正确度

指该检测程序测定的结果与真实值或参考接近的程度。 值4.1.1验证方法：本采用对组照试验，将床检临

聚合酶链反应(PCR)检测技术是一种体外DNA扩增技术。其基本原理是酶促DNA合成反应,即在模板DNA、引物和脱氧核糖核酸存在及DNA聚合酶的作用下,使DNA链扩增。由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。随着微生物基因组学的发展,对淋球菌的基因结构越来越清楚。1985年Korch等克隆出隐蔽性质粒基因(cppB),1988年Rossau等发现淋球菌16SrRNA存在着另一个独立的基因区域,这个基

维普资讯

中国卫生检验杂志 2 0 0 8年 4月第 1 8卷第 4期

C i s ora f e t aoa r eh o g, p 0 8;o 8 N hn eJunl ahL brt yT cnl y A r 0 V l o4 e oH l o o 2 1

73 6

【综述】

淋球菌PR C检测技术研究进展周炳可(西上思县疾病预防控制中心，西上思广广[键词]淋球茵；关聚合酶链反应；测技术检[中图分类号] R 9 . 1 32 1[文献标识码] A [章编号] 10 8 8 (0 8 0 06 0文 04— 6 5 20 )4— 7 3— 3 55 0 ) 3 50

聚合酶链反应 ( C检测技术是一种体外 D A扩增技 P R) N术。其基本原

目的为快速、特异、灵敏的检测致病性弧菌,建立致病性弧菌的实时荧光PCR方法。方法针对霍乱弧菌的种特异性基因ompW、毒力基因tcpA、ctxA和副溶血性弧菌的种特异性基因tl、毒力基因tdh设计引物和Taqman荧光探针,建立实时荧光PCR检测方法。结果该方法能够特异性地检出副溶血性弧菌或霍乱弧菌,并进一步确定其是否携带tdh、tcpA或ctxA毒力基因,检测的灵敏度可达到10CFU/ml或0.1716μg

维普资讯

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实验技术与方法

2种弧菌的实时荧光 P R快速检测 C冯家望王小玉李丹琳唐食明游淑珠 (海出入境检验检疫局，珠广东珠海 5 9 1 ) 10 5

摘要： 为快速、、的检测致病性弧菌，目的特异灵敏建立致病性弧菌的实时荧光 PR方法。方法针对霍乱弧 C茵的种特异性基因 o p、力基因卸 A、tA和副溶血性弧茵的种特异性基因 t毒力基因 f设计引物和 mW毒 c x l、 Tq a am n荧光探针，立实时荧光 P R检测方法结果该方法能够特异性地检出副溶血性弧茵或霍乱弧茵

核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素

中国人民解放军第302医院 王海滨

一、临床分子生物学检验面临的问题与挑战

（一）国家药监局审评中心新行规：核酸提取是关键！ 1. HBV DNA 敏感性报告 <30IU/ML ，防止实验室污染问题！ 2. 标本加样量不少于 200 微升；干扰与敏感性的矛盾！ 3. 核酸加样量不少于 20 微升、反应体积不少于 40 微升！ 4. 磁珠法应用的挑战！血站核酸筛查？ 5. 定量内标漂移对结果的影响

6. 试剂盒考核：增加抗污染和敏感性能评价指标！ （二）不同核酸提取方法对检测质量的影响

影响核酸提取的因素有很多，以磁珠法、层析柱法、碱性裂解法及生物合成材料进行比较。 标本： 200 微升血清

方法：磁珠法：市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇； 层析柱法：市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇； 碱性裂解法： PEG 介导； 生物合成材料：无胍、无醇。

PCR 扩增：取等体积提取核酸或磁珠悬液（ 10 微升），同一 PCR 扩增液。

我们采用四种方法材料进行同一样本核酸提取，然后采用统一试剂对相同提取核酸进行 PCR 扩增，结果差别非常大，磁珠法和层析柱法基本差不多，层析柱法稍微滞后于磁珠法，碱性裂解法最差，而且 100IU 无结果。复合材料的敏感性，是磁珠法或层析柱法的 30 倍左右。

过去，我们对荧光 PCR 试剂或分子生物学试剂，往往关注扩增部分，而把提取部分忽视了，现在来看，提取部分也非常重要。 二、临床实验室核酸制备方法分类 （一）临床

核酸提取对临床荧光PCR检测质量的影响因素

中国人民解放军第302医院 王海滨

一、临床分子生物学检验面临的问题与挑战

（一）国家药监局审评中心新行规：核酸提取是关键！ 1. HBV DNA 敏感性报告 <30IU/ML ，防止实验室污染问题！ 2. 标本加样量不少于 200 微升；干扰与敏感性的矛盾！ 3. 核酸加样量不少于 20 微升、反应体积不少于 40 微升！ 4. 磁珠法应用的挑战！血站核酸筛查？ 5. 定量内标漂移对结果的影响

6. 试剂盒考核：增加抗污染和敏感性能评价指标！ （二）不同核酸提取方法对检测质量的影响

影响核酸提取的因素有很多，以磁珠法、层析柱法、碱性裂解法及生物合成材料进行比较。 标本： 200 微升血清

方法：磁珠法：市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇； 层析柱法：市场销售试剂盒，介质为胍盐、乙醇； 碱性裂解法： PEG 介导； 生物合成材料：无胍、无醇。

PCR 扩增：取等体积提取核酸或磁珠悬液（ 10 微升），同一 PCR 扩增液。

我们采用四种方法材料进行同一样本核酸提取，然后采用统一试剂对相同提取核酸进行 PCR 扩增，结果差别非常大，磁珠法和层析柱法基本差不多，层析柱法稍微滞后于磁珠法，碱性裂解法最差，而且 100IU 无结果。复合材料的敏感性，是磁珠法或层析柱法的 30 倍左右。

过去，我们对荧光 PCR 试剂或分子生物学试剂，往往关注扩增部分，而把提取部分忽视了，现在来看，提取部分也非常重要。 二、临床实验室核酸制备方法分类 （一）临床

第32卷第3期浙江师范大学学报(自然科学版)V o.l32,N o.3

2009年9月Journa l o f Zhe ji ang N or m a lU n i ve rsity(N at.Sc.i)Sep.2009

文章编号:1001-5051(2009)03-0317-05

对动物组织DNA提取方法的改进及PCR检测*

鲍毅新,孙波,张龙龙,赵庆洋

(浙江师范大学生态研究所,浙江金华321004)

摘要:以小型哺乳动物社鼠为例,通过调整酚与氯仿的比率、减少抽提次数及消化时间,对采用-70e超低温冰箱、-20e低温冰箱、70%乙醇液浸泡、95%乙醇液浸泡和含50mmo l/L乙二胺四乙酸二钠的70%乙醇液浸泡等不同方法保存的社鼠肌肉组织提取基因组DNA,并对其进行微卫星指纹图谱分析,研究了改进方法对不同方法保存的社鼠肌肉组织提取DNA的效果,并比较了不同保存方法对DNA提取效果的影响.结果表明:改进方法可行,完全可以满足微卫星等分子标记技术的需要.

关键词:社鼠;DNA提取;聚合酶链反应;动物组织;样品保存

中图分类号:Q95-3文献标识码:A

The i m prove m ent for m ethod of DNA extraction fro m

1. 如果要增加特异性，要考虑是否升温，复性时候的较高温度有利于筛选特定片段，减少其他GC丰富片段的竞争。

2. 考虑使用甘油：加甘油也可以的,一般终浓度在10%左右.我的实验也曾遇到过GC高达73%的情况,加过甘油非特异性改善了很多,你不妨试一下.

3. 使用甜菜碱：

DMSO can usually give results in GC-rich regions when used at a final

concentration of 5%, although there are reports in the literature of

genes which required 10% DMSO, so a bit of experimentation may be

necessary to optimise the concentration for your genes. Alternatively,

addition of Betaine to concentrations of 1M in reactions can also be

beneficial in GC-rich regions.

There was a comparison pub

RT-PCR实验步骤

一、总RNA提取

1）试剂配制

1. 0.1TPC水：1000mL双蒸水中加入1mLDEPC，室温下静置4小时。（①用来泡使用

器具处理12小时；②在120℃下高压灭菌30分钟后室温放置备用用来溶解RNA。） 2. 氯仿 3. 异丙醇

4. 75%乙醇：用无水乙醇和高压后的DPEC水配制，现配现用。

2）操作步骤：

1. 样品处理

a. 组织：将组织放在液氮中磨碎（低温处理）。每50-100mg组织加1mL裂解液TRZOL，

用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液TRZOL体积的十分之一。 b. 单层培养细胞；直接在培养板上加入裂解液TRZOL裂解细胞，每10cm2面积加1mL

TRZOL。用取样器抽打几次。（注意：裂解液RZ的加入量根据培养瓶面积决定，不是由细胞数决定。如果加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。）

c. 细胞悬液：离心取细胞，弃上清。每5-10×106动物细胞和植物细胞加入1mL裂解液RZ。

加裂解液RZ前不要洗涤细胞，以免降解RNA。

d. 血液：直接取新鲜血液，加入3倍体积RZ（推荐0.25mL血液+0.75mLRZ），充分震荡

混匀。

2. 将裂解样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白质复合

iCycler iQTM荧光实时多波长PCR检测系统

操作说明

iCycler iQTM Multi-Color Real Time PCR Detection System

Operating Instructions

Catalog Number

170-8740

如与英文版说明书有不符之处以英文版说明书为准

1

2．iCycler iQTM荧光实时多波长PCR检测系统操作速成

2.1 简介：

iCycler iQTM荧光实时多波长PCR检测系统可以最多一次检测96个样品，且每个样品中同时可以检测4个不同波长的荧光信号。也就是说，只要标记不同荧光探针，iCycler可以对同一个孔中两种以上的PCR产物（最多四种）同时进行实时分析。这样对多重PCR反应或使用内对照（Internal Control）定量的PCR反应的检测就十分方便。

在反应过程中，不同的荧光信号通过与其匹配的不同波长的滤光镜组来检测。比如，在一个反应管中同时有四种荧光探针共存，分别标记了FAM、HEX、Texas Red?和CyTM5，在收集其荧光信号数据的时候，必须同时使用FAM滤光镜组、HEX滤光镜组、Texas Red滤光镜组和Cy5滤光镜组。所有的收集的信号由i