液相色谱方法及应用

一般情况下，HPLC分离方法的建立遵循以下步骤：

(1)了解样品的基本情况

所谓样品的基本情况，主要包括样品所含化合物的数目、种类(官能团)、分子量、pKa 值、UV光谱图以及样品基体的性质(溶剂、填充物等)、化合物在有关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。

(2)明确分离目的

①是分析组分还是制备样品；

②是否已知样品所有成分的化学特性，或是否需做定性分析；

③是否有必要解析出样品的所有成分(比如对映体、非对映体、同系物、痕量杂质)；

④如需做定量分析，精密度需多高；

⑤建立的方法将适用几种样品分析还是许多种样品分析；

⑥将使用最终方法的常规实验室中已有哪些HPLC设备和技术。

(3)了解样品的性质和需要的预处理

除非样品是适于直接进样的溶液，否则，高效液相色谱分离前均需进行某种形式的预处理。有的样品需加入缓冲溶液以调节pH值；有的样品含有干扰物质或“损柱剂”而必须将其去除。此外，为了保证最终的样品溶液与流动相的成分尽量相近，最好用流动相溶解(或稀释)样品。

(4)检测器的选择

不同的分离目的对检测的要求不同，如测单一组分，理想的检测器应仅对所测成分响应，而其他任何成分均不出峰。另外，如果目的是定性分析或是制备色谱，则最好有通用型检测器，以便能检测到混合物中的各种成分

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高效液相色谱法习题

一、思考题

1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么? 4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？

7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么?

10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？ 12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？

13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理

14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有

液相色谱常见问题及处理方法

液相色谱常见问题及处理方法

HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

1、样品量不足，解决办法为增加样品量

2、样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

3、样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器

4、检测器衰减太多。调整衰减即可。

5、检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数

6、检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。

7、检测池中有气泡。解决办法为排气。

8、记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。

9、流动相流量不合适。调整流速即可。

10、检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

为什么HPLC柱柱压过高

柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

1、拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；

2、把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；

3、将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒

1、高效液相色谱 仪器设备名称 高效液相色谱仪 数量 1 技术指标四元梯度输液泵：工作模式：相互独立、电子控制的双柱塞直线驱动装 置，双压力传感器反馈回路，无需混合器和阻尼器。溶剂数：1—4。 流速范围：0.010—10.000ml/min, 以 0.001ml/min 为增量。流速精度： ≤0.075%RSD，流速准确度：±1.0%。操作压力：0—5000psi。混合范围： 0.0—100.0% 以 0.1% 增量。梯度曲线：多种梯度曲线，线性、步进、 凸线和凹线。 光电二极管阵列检测器：波长扫描范围：190～800nm。光源：全程氘灯 （190～800nm），不用钨灯。波长准确度：±1nm。测量范围：0.0001～ 2.0000AUFS，可以设定波长范围扫描检测或者定点波长检测。 荧光检测器（2475型）：灯：150W 氙灯，连续弧光。检测限：水的拉 曼光谱 ≥ 1000，激发波长：200—890nm，发射波长：210—900nm， 波长重现性：±0.25nm，波长准确度：±3nm。 色谱软件：原版软件。 仪器组成：四元泵、手动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、荧光检 测器、C18色谱柱、保护柱、原装软件、其它设备运行必须品。

高效液相色谱原理

1、概述

在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。

气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。

2、液相色谱流程图 1、储液罐；2输液泵；3、进样器；4、色谱柱； 5、检测器；6、工作站；7废液灌

3、原理

液相色谱根

高效液相色谱在药学中的应用 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪70年代发展起来的一项高效、快速的分离分析技术已被广泛用于各个领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域应用最广、发展最快的现代分析技术之一。有的已被列入药典，成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。 与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细（一般为10μm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。 与气相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；②可选用不同性质的各种溶剂作为流动相，而且流动相对分离的选择性有很大作用，因此分离选择性高；③一般在温室条件下进行分离，不需要高柱温。 高效液相色谱的研究应用进展 药物与人类的健康，生活质量的提高关系极大，许多药

岛津液相色谱分离条件优化思路

岛津国际贸易(上海)有限公司分析仪器事业部 分析中心

1

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建立HPLC方法步骤(1)了解样品信息，分析目的和要求

样品的制备 选择检测方法和条件

优化分离条件

定性、定量分析

分析方法验证

2

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有关样品组分和性质的重要信息1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 化合物的结构以及具有的官能团 化合物的分子量 化合物的酸碱性和pKa 值 样品适宜的溶剂及溶解度 化合物的UV特征 可能相关物质的数目 供试品的特性，如含有的基质、溶剂等 样品中要检测的各组分的含量范围

3

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明确分析的目的 定性分析还是定量分析？ 主成分分析还是相关物质分析？ 是否为手性分析？ 是否为微量或痕量分析？ 如为定量分析，要求方法的精度？ 分离的对象，如原料、制剂、工艺中间体等？ 自己实验室应用还是常规的质控分析方法？

4

高效液相色谱习题

一：选择题

1.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（ ）

A.提高柱温 B.降低板高 C.降低流动相流速 D.减小填料粒度 2.在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进下列那种操作（ ） A. 改变固定液的种类 B. 改变栽气和固定液的种类 C. 改变色谱柱温 D. 改变固定液的种类和色谱柱温 3.在液相色谱中，范第姆特方程中的哪一项对柱效的影响可以忽略（ ） A.涡流扩散项 B.分子扩散项

C.流动区域的流动相传质阻力 D.停滞区域的流动相传质阻力

4. 在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选用 ( ) A.适当提高柱温 B.增加固定液含量 C.增大载体颗粒直径 D.增加柱长 5. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是 ( )

A. 高压泵 B. 梯度淋洗 C. 贮液器 D. 加温

7. 在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力？（ ）

A. 组分与流动相 B. 组分与固

高效液相色谱习题及参考答案

一、单项选择题

1. 在液相色谱法中，按分离原理分类，液固色谱法属于（ ）。

A、分配色谱法 B、排阻色谱法 C、离子交换色谱法 D、吸附色谱法

2. 在高效液相色谱流程中，试样混合物在（ ）中被分离。

A、检测器 B、记录器 C、色谱柱 D、进样器 3. 液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？

A、0.5μm B、0.45μm C、0.6μm D、0.55μm 4. 在液相色谱中，为了改变色谱柱的选择性，可以进行如下哪些操作？ A、改变流动相的种类或柱子 B、改变固定相的种类或柱长 C、改变固定相的种类和流动相的种类 D、改变填料的粒度和柱长 5. 下列用于高效液相色谱的检测器，（ ）检测器不能使用梯度洗脱。 A、紫外检测器 B、荧光检测器 C、蒸发光散射检测器 D、示差折光检测器 6. 在高效液相色谱中，色谱柱的长度一般在（ ）范围内。

A 、10～30cm B、 20～50m