基因克隆实验原理

整个基因克隆实验规程

完整

Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】

一、组织总RNA 的提取

相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水

相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、

100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。

相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。

实验步骤

1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅

速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。

2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；

3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；

4.4℃，,12000g 离心15min；

此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；

5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等

体积的异丙醇，轻轻混匀；

6.室温放置10

基因克隆的质粒载体

在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。

①F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

③Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

第一节 质粒的一般生物学特性

一、质粒DNA

细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。

1

质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：

1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），

基因程原工理纲要第一 第二讲讲基 因程工论属实 基概因工的程主技要术第三讲第四讲

因基工的程酶学础基因克基的隆体载与受体第五讲第六讲

目基的因克隆与分的离隆克基因检的测鉴定与第七讲第八讲克隆因基的表达与物产纯基化表达因调控的

六第

讲隆基因克的检测鉴与定载体型表选法择根据入基因插表型的选择D A电泳检N测 核法杂酸交测法 检免疫学化检法 转测筛选法

译

一节第载体表 型择法选、一药性抗标及其插入记失选择法活1. 理：pB原3R22粒上有质个两菌抗抗性素因: Te基t和rAmpr Tet。上有插入位r点amHB I和Sa Il; mpr上有插入位AP点s t。I

pR3B22

2. pR322B菌抗标记选择素(1)四素环： 抑制细生长，菌不但死细菌。杀

(2氨)青苄素抗性基因霉：生 产-内胺酰，使酶氨苄霉素转青为变青霉酮 酸，使碘青-素霉指示(液2I-I-KampiAclilin (蓝灰色)褪色。)(3环丝氨)酸杀死：长生细菌的但不杀，停止死生的细长菌。

3.

选择程：过(1四环素抗性)插入失 活如在Tet果r上插外源入DA,导N致四环 素性基因抗活，失用四环素加环可氨酸平 板丝培基养选重组择隆克。 Ttr失活的e生长菌被四素抑环，制不被丝环氨酸杀死， 留下保；

拟南芥基因的图位克隆技术

拟南芥基因的图位克隆技术

浙江大学生命科学学院 徐冰

浙江杭州 310029

1 国内外研究现状

拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。

从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。

图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等， 2002）

图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（po

细胞克隆形成实验

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：

一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。

实验方法：

平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验

(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞

(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。

平板克隆形成实验基本步骤：

1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀

细胞克隆形成实验

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：

一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。

实验方法：

平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验

(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞

(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。

平板克隆形成实验基本步骤：

1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀

一.基因工程的概念：

1.限制性内切酶:识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键，在特定部位限制性地切割 DNA分子。

2.Southern杂交:将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。

3.Northern杂交:是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。

4.反义RNA技术:反义RNA 是指与靶RNA 具有互补序列的RNA 分子, 它通过与靶RNA 进行碱基配对结合调节结构基因的表达。 二.需要了解的简单知识 1.限制性内切酶的分类

Ⅰ型限制性内切酶：多聚体蛋白质，具有切割DNA的功能，作用时需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸的存在。切割DNA的方式是，先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互作用，然后沿着DNA分子移动，在行进相当于1000~5000个核苷酸的距离之后在随机位置上切割单链DNA。

Ⅱ型限制性内切酶：分子量较小的单体蛋白，作用时仅需要Mg2+存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段

以谷子(Setaria italica)为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,

植物学通报（6）：A""A，:;6!"[6!>

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摘要

关键词

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"谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析!李园莉!江元清!赵武玲"阎隆飞北京!"""#$）（中国农业大学生物学院，植物生理学与生物化学国家重点实验室以谷子（!"#$%&$&#$’&($）为材料，提取总%&’。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物，用(’%’)*方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白+,&’作探针进行的-./01234杂交分析表明扩增出了目的基因。将所

以谷子(Setaria italica)为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,

植物学通报（6）：A""A，:;6!"[6!>

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"谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析!李园莉!江元清!赵武玲"阎隆飞北京!"""#$）（中国农业大学生物学院，植物生理学与生物化学国家重点实验室以谷子（!"#$%&$&#$’&($）为材料，提取总%&’。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物，用(’%’)*方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白+,&’作探针进行的-./01234杂交分析表明扩增出了目的基因。将所

- 1 - 单位代码 10635

学 号

S2005073

硕士学位论文

豌豆早期结瘤素基因克隆与凝集素基因psl

转化烟草研究

论文作者：周小全

指导教师：张兴国 研究员

学科专业：细胞生物学

研究方向：细胞工程

提交论文日期：2008年05月25日

论文答辩日期：2008年05月31日

学位授予单位：西南大学

中 国 重 庆

2008年5月

- 2 -

2008 Master Thesis of Southwest University

Isolation of Early nodulin Genes from Pisum sativum and Introduction of Lectin Gene psl into Nicotiana tobacum

Candidate：Xiaoquan Zhou

Supervisor：Xingguo Zhang

Major：Cell biology

Field：Cell engrneering

College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University，Beibei，Chongqing，400715，P