western blot的过程

Western Blot

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。

实验器材和试剂：

一． 蛋白提取试剂

1.10% SDS裂解液：

称取10g SDS粉末加入双蒸水至90mL，充分溶解，定容至100ml室温保存。 2.RIPA裂解液

1ml裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/

Western blot

所涉及的Western blot实验在蛋白上样缓冲液中均加有巯基乙醇，上样之前加入终浓度为50 mM的DTT在60oC处理10分钟。

本论文所涉及的Western blot实验所用的SDS-PAGE蛋白胶的浓度均为8%。

拟南芥总蛋白提取：

(1) 在1.5 ml EP管中用液氮研磨200 mg植物材料； (2) 加入200 μl提取液后继续研磨直到植物材料重复磨碎；

(3) 4 oC高速（13000rpm）离心15分钟，取上清移入一个新的EP管； (4) 4 oC高速重复离心15分钟，取上清移入一个新的EP管； (5) 提取好的蛋白溶液可分装到多个EP管，冻于-80 oC备用。 蛋白质浓度的测定（Bradford法）：

材料和方法

(1) 分别在两组1.5 ml离心管中各加入0.5 mg/ml BSA（5，10，15和20 μl）， 以0.15 mmol/L NaCl补足至100 μl，同时以两管100 μl的0.15 mmol/L NaCl做空白对照；

(2) 每管各加入1 ml考马斯亮蓝溶液，振荡混匀，室温放置2分钟； (3) 以波长595 nm测量OD值，取A线，并测量待测样品

Western_Blot过程步骤详解

Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:

一、原理

二、 分类

i.放射自显影

ii.底物化学发光ECL

ECF

iv.底物DAB呈色

三、 主要试剂

四、 主要步骤

五、 实验常见的问题指南

1.参考书推荐

2.针对样品的常见问题

3.抗体

4.滤纸、胶和膜的问题

5.Marker的相关疑问

6.染色的选择

7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题

9.条件的摸索

10.方法的介绍

11.结果分析

一、 原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素

Western_Blot过程步骤详解

薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多

Western blot

一、Western blot历史及原理

蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，简称WB。1975年，继Edwin Southern发明的“Southern Blot”，1977年George Stark及其同事发明的“Northern Blot”技术之后，受以上两个“转印”技术的启示，1981年“Western Blot”这一技术正式问世。抗体技术的发展，电泳及转膜技术的改进使得Western Blot操作日益简单；分析方法及工具多样化、成像技术的革新、高灵敏度示标信号的出现使得Western Blot的检测范围得到扩展，定量/半定量成为可能。目前Western Blot设备不断更新、技术不断发展，WB仍将在较长时间和应用领域内得到更加广泛的应用，其检测灵敏度也将不断提高。

其基本原理与ELISA相似：通过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离混合蛋白质样品，转印到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以转印到固相载体上的蛋白质（多肽）作为抗原，与对应的抗体（又称一抗）特异性结合，特异性抗体再与酶、荧光素或同位素标记的抗一抗抗体（

Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:

一、原理

二、 分类

i.放射自显影

ii.底物化学发光ECL

ECF

iv.底物DAB呈色

三、 主要试剂

四、 主要步骤

五、 实验常见的问题指南

1.参考书推荐

2.针对样品的常见问题

3.抗体

4.滤纸、胶和膜的问题

5.Marker的相关疑问

6.染色的选择

7.参照的疑问

Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

8.缓冲液配方的常见问题

9.条件的摸索

10.方法的介绍

11.结果分析

一、 原理

与Southern或Norther

Western Blot

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。

实验器材和试剂：

一． 蛋白提取试剂

1.10% SDS裂解液：

称取10g SDS粉末加入双蒸水至90mL，充分溶解，定容至100ml室温保存。 2.RIPA裂解液

1ml裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/

8.1.3 细胞收集与裂解

（1）细胞收集：常规胰蛋白酶消化、离心收集细胞于1.5mL eppendorf无菌管，并做好标记。（2）细胞洗涤：4℃，2500rpm离心5分钟，用4℃预冷的1×PBS洗涤两次。（3）细胞裂解：用100μL事先配好的含有1mM PMSF的RIPA裂解液吹打悬浮细胞，放入-20℃冰箱15分钟，再次吹打悬浮，放入-20度冰箱15分钟。（4）蛋白离心：如此重复两次后，4℃，12000rpm离心10min，取上清（蛋白质）。（5）蛋白总浓度测定：取5μL（或2-5μL）上清用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白总浓度，实验根据说明书实验步骤操作，测出蛋白-吸光度标准曲线及各组蛋白总浓度。（6）蛋白变性：剩余蛋白样部分以4:1的体积比与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀，沸水浴5min。（7）蛋白浓度均一化：待样品自然冷却后，根据蛋白浓度测定结果，用RIPA稀释好的1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液将各组蛋白调至相同浓度，放入-20度冰箱保存备用。

8.2 SDS-PAGE胶配制

（1）10% SDS-PAGE下层胶配制：按照说明书，依次加入相应体积的超纯水、30?r-Bis、下层胶缓冲液（4×）、10%A

蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析

Western Blot基本原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。

Western Blot应用：目的蛋白的表达特性分析，目的蛋白与其它蛋白的互作，目的蛋白的组织定位，目的蛋白的表达量分析。

Western Blot 流程：蛋白样品的制备，制胶，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗杂交，二抗杂交，底物显色。 （一）蛋白样品的制备：

提取总蛋白:所有操作在冰上进行,且所有操作要对着容器壁操作，防治将细胞吹落；操作前先用PBS将细胞洗2变。

1.将原瓶/皿中放入5ml生理盐水或PBS，根据细胞团块大小加入100-300μl RIPA裂解液，吹匀后，4℃摇床30min。

2. 4℃，12000×g 15min，离心后取上清，测浓度。

BCA蛋白浓度测定方法： 原理

碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在570nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 特点

1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25微克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，待测样品体积为1-20微升。

2. 在50-2000微

蛋白质免疫印迹技术及

常见问题分析张绍进

Western Blot

Western Blot简介

Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析

Western Blot

Western Blot 简介：

印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上，而后利 用相应的探测反应来检测样品的一种方法。

1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方 法，称为Southern印迹法。

而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后 蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

Western Blot

Western Blot 基本原理

Western Blot

Western Blot 优点

高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应

1-5ng中等大小的靶蛋白

Western Blot

Western Blot应用

目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析

Western

Western Blot试剂的准备

1. 30%储备胶溶液：

丙烯酰胺（Acr） 29.0g

亚甲双丙烯酰胺（Bis） 1.0g

混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。

2. 4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl PH 8.8） Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。

3. 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8） Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。

4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。

5. 5×电泳缓冲液（PH 8.3）： Tris 15.2g 甘氨酸 94g

ddH2O 定容到1000ml