主动运输载体蛋白磷酸化

质粒载体单酶切后的去磷酸化

1、 去磷酸化体系的确定：

一般有两种体系：20ul体系和50ul体系

ddH2O X to 20ul SAP buffer 2ul

SAP 1ul（一般0.05-2μg的DNA用1ul的SAP足够） 质粒载体 m ul [m=（0.02nmol*质粒大小kb*660）/质粒浓度] 2、 反应条件：

37℃反应30-60min

65反应15-30min（灭活SAP）

用1X TE将去磷酸化后的载体补足300ul（为了下一步纯化载体时减少损失）

载体纯化（个人不建议用胶回收柱纯化，因为纯化的效率很低，除非你的载体浓度很高或者你的柱子效率很高。建议使用酚氯仿纯化DNA的方法纯化载体） 加入 酚：氯仿：异丙醇（25: 24:1） 300ul 充分混匀10min左右

8000rmp离心5min，分层后小心吸取上清于新离心管（千万不要吸到中间层，宁肯少吸点上清）

加入300ul异丙醇于上清中，充分混匀

80

蛋白质磷酸化与信号传导

蛋白質磷酸化與信號傳導

對所有真核生物而言，蛋白質的磷酸化是細胞內信號傳遞的關鍵步驟，舉凡在細胞代謝、生長、增殖、癌變調控方面，蛋白質的磷酸化都扮演著重要角色。目前在真核細胞內已發現有400多種蛋白激酶和1000多種磷酸蛋白。通過蛋白質磷酸化，機體得以改變細胞內蛋白質活性，或藉以改變酵素活性、或藉以傳遞信號、或調節細胞內各個生理過程。隨著愈來愈多的信號傳導路徑被證實與蛋白質磷酸化相關，此一主題己是當今細胞生物學研究的熱點。

蛋白質的可逆磷酸化

蛋白質的磷酸化和去磷酸化是一個可以相互轉化的過程，分別由機體藉由調控細胞內各類蛋白激酶（protein kinases）和蛋白磷酸酶（phosphatases）的活性來啟動或抑制。通過磷酸化和去磷酸化兩種構象的互變，導致蛋白質活性改變而表達其特殊的生理功能。現已證實，細胞的許多功能蛋白，如激酶、酶蛋白、受體、視蛋白、運輸蛋白、收縮蛋白、調節蛋白、核蛋白、離子通道、離子幫浦等，均能發生蛋白質的磷酸化與去磷酸化。蛋白質磷酸化的方式有兩種：一種是蛋白質自身磷酸化，如胰島素受體、C激酶、G激酶、Ca2+·CaM激酶、EGF受體、PDGF受體、IGF-1受體、FGF受體、CSF-1受體、

中国药物与临床2012年1月第12卷第1期Chinese Remedies &Clinics ，January 2012,Vol.12,No.1肺间质纤维化是一种渐进性加重的致命性弥漫

性肺疾病。肺内成纤维细胞和损伤的气道上皮细胞

向肌成纤维细胞转分化是特发性肺纤维化发生的重

要病理因素［１］，α鄄平滑肌肌动蛋白（α鄄ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ

ａｃｔｉｎ，α鄄ＳＭＡ）是研究肌成纤维细胞分化的标记物。

近年来，肺纤维化转分化病理过程中涉及到的信号

通路一直是研究的热点。ｃ鄄ｊｕｎ氨基末端激酶（ｃ鄄ｊｕｎ

ＮＨ２鄄ｔｅｒｍｉｎａｌｋｉｎａｓｅ，ＪＮＫ）

信号通路参与调控许多细胞增殖、分化与凋亡，是丝裂原活化蛋白激酶家族的

重要一员［２］。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ等［３］发现ＪＮＫ信号通路在人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中发挥作用，而关于体内ＪＮＫ信号通路在肺纤维化转分化过程中是否发挥作用尚未见相关研究报道。ＳＰ６００１２５作为ＪＮＫ激酶抑制剂，可特异性阻断ＪＮＫ细胞信号通路［４］。本实验使用ＳＰ６００１２５进行干预，通过观察大鼠肺组织中ｐ鄄ＪＮＫ和α鄄ＳＭＡ的表达水平，从分子信号角度探讨肺纤维化转分化的发病机制。1材料与方法１．１主要试剂及药品：盐酸博莱霉素（ＢＬＭ，

NovelZincPhosphateTopologiesDefinedbyOrganicLigands

JianFanandBrianE.Hanson*

DepartmentofChemistry,VirginiaPolytechnicInstituteandStateUniVersity,Blacksburg,Virginia24061

ReceivedMarch1,2005

Sixnewzincphosphates[C18H20N4][Zn4(HPO4)4(H2PO4)2(C18H18N4)3] 2H2O(1),[Zn4(HPO4)4(C18H18N4)3] 4H2O(2),[Zn3(HPO4)3(H2PO4)(C22H22N8)0.5(C22H24N8)0.5](3),[Zn2(HPO4)2(C18H16N4)](4),[Zn(HPO4)(C18H14N2)](5),and[Zn2-(HPO4)2(C12H10N4)](6)havebeensynthesizedundermildhydrothermalconditionsinthepresenceof1,4-bis(N-benzimidazolyl)butane(L1),1,2,4,5-tet

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因cDNA克隆及其在甲醇毕赤酵母中的表达

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2005,13(3):282~287

··研究论文

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基

基因(的克隆及其在毕赤酵母中的表达*

宋波涛柳俊**谢从华成善汉

(华中农业大学园艺林学学院，国家蔬菜改良中心华中分中心，园艺植物生物学教育部重点实验室，

湖北省马铃薯工程技术研究中心，武汉430070)

摘要：用RT-PCR结合RACE的方法，在腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因(温处理的马铃薯(

目标片段为体。DNA序列测定结果表明，

从低的保守位点设计1对引物，

L.)块茎cDNA中，扩增出1条约1.9kb的特异性条带，并将其克隆到pBluescriptSK域载

编码521个氨基酸。全长为1854bp，包含一个1563bp的开放阅读框架，5'端

有63bp的非翻译区，3'端包含219bp的非编码序列，3'端poly(A)尾端上游12和19bp处有加尾信号AATAAA。该基因已在GenBank注册，登记号为AY186620。将该基因PCR突变后，克隆到酵母表达载体pMET琢-B中，构成表达

BioTek应用手册

A p p l i c a t i o n N o t e

药物筛选

一种常见的GPCR传感器-ERK1/2的自动均相磷酸化检测 -均相LanthaScreen®细胞分析

Paul Held and Peter Banks, BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT

Kristin Huwiler, Matthew Robers, and Bonnie Hanson, Life Technologies, Madison, WI

关键词：GPCR, LanthaScreen, ERK，TR-FRET

GPCRs的激活会刺激活化各种信号通路，大部分信号通路的激活均可能导致细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化。因此，针对ERK1/2的磷酸化检测可以代替GPCRs的活性检测。本文介绍了一种将BacMam调节的GFP-ERK2 传感器基因传递技术和LanthaScreen®细胞学实验技术相结合的时间分辨荧光共振能量转移技术（TR-FRET），该技术用来检测ERK2细胞外的磷

第一节 物质运输的载体

一、血液的组成和功能 1.观察加入抗凝剂的血液

血浆

白细胞 血小板 红细胞

血细胞

血液分层图

血 浆 血 液

红细胞 白细胞 血小板

血细胞

成分： 水，蛋白质，葡萄糖，无机盐等。 功能： 运载血细胞； 运输营养物质和代谢废物。

血 浆 血 液

红细胞 白细胞 血小板

血细胞

实验：观察人血的永久涂片

讨论： 1.数量最多的 血细胞是哪 一种？最少 的呢？ 2.你怎样区分 红细胞和白 细胞？

实验：观察人血的永久涂片

最少；最大 最小 最多

红 细 胞

双面凹的圆饼状。 a.形态： 无细胞核，含血红蛋白。 b.结构： 富含血红蛋白，运输氧。 c.功能：

1.高原地区的人与平原地区的人相比，血红蛋 白含量有什么不同？

血红蛋白含量更高。 2.玻璃管底部的红细胞容易与氧结合吗？

容易与氧分离，呈暗红色。

3.红细胞数量过少，或者血红蛋白含量过低， 会出现什么症状？ 贫血症状。 4.贫血的人应该多吃一些富含哪些营养成分 的食物？ 蛋白质和铁。

白 细 胞

a.结构：有细胞核。 吞噬细菌，防御疾病。 b.功能：

如果某人体内发生炎症，其白细胞的数 量会有什么变化？ 白细胞数目增多。

血小板

a.结构： 无细胞核。

b.功能： 止血、加速凝血。 在显微镜下有时看不到白细胞，血小

《物质运输的载体》第一课时的教学设计

一、教材分析

《物质运输的载体》一节是鲁教版七年级下册第三章《人体物质的运输》第一节的内容，《物质运输的载体》之所以做为循环系统的第一节，首先因为这章在学习第一章和第二章后，食物中的营养物质和大气中的氧是如何运输到组织细胞的？组织细胞代谢的废物是如何排除体外的？这必须经过血液循环才能实现。可见本章和前两章的联系密切，也为学习第四章做好铺垫。“人体内的物质运输，是靠血液的循环实现的”。并由此展开血液运输的功能，血液为什么有这种功能呢？这主要与血液的成分有关系的自然过渡。 二、教学设计理念

21世纪随着生物学的迅猛发展，从根本上改变着它在自然界中的地位和作用。根据生物学自身的特点及学生的认知规律，在《物质运输的载体》一节教学中，主要通过多媒体教学课件和演示实验的观察以身边生活实例等活动的学习，求培养学生主动和创新思维、观察归纳总结能力；在生活中能充分发挥教师主导和学生的主体作用，采用多种教学手段来调动学生的积极性和求知欲；结合学生特点，注重教学过程中的情感教育，师生在愉快中学习。 三、 教学目标

知识目标：

（1）了解血浆和血液的成分及功能。 （2）掌握血细胞的形态和功能。 （3）会解读和识别血常规化验单。 能力目标：

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人体运动能力及蛋白质的载体作用

作者：佐热古丽.热依木

来源：《新农村》2010年第06期

摘要：适当补充蛋白质可提高运动能力，促进恢复和消除疲劳。过多补充蛋白质不仅对机体不利，反而有害。由于蛋白质的特殊食物动力作用，会使机体耗氧量增多，加大心肺功能负担。同时其代谢产物肌酐、尿素等增多，加大肝、肾功能负担，对机体运动反而不利，延缓疲劳的消除。所以，在蛋白质补充时，应根据不同运动项目的特征、运动强度的大小和运动持续时间的长短来进行补充。

关键词：人体机体蛋白质运动能力神经系统

蛋白质是生物体的三大营养物质之一，是生命活动的基础，是塑造一切细胞的组织结构的重要组成成分。正常人体蛋白质含量约占体重的45％。由20种氨基酸组成的蛋白质在功能活动中表现出千差万别。

一、蛋白质的有关生理功能

1.蛋白质构成机体组成成分。蛋白质是细胞的主要组成成分，在细胞膜的组成结构中，各种不同功能的球形蛋白质镶嵌在双层脂质分子之间，是细胞膜结构的主要组成成分，其质量约为脂质的l－4倍。不仅细胞膜中有蛋白质，而且蛋白质也是其它生物膜如核膜、线粒体膜及

肌肉等组织的组成成分。

2.维持组织更新、修复和调节生长发育。由于蛋白质是机体组织的重要组成成分，机体在新陈代谢过程中，不断与外

2010级高一生物同步教学学案 必修一《分子与细胞》第二单元细胞的自我保障 第一章细胞中的蛋白质 编制 陈秀兰 审核 张经军 日期 2010、9、18 班级 姓名 第二节蛋白质的合成与运输 【目标引领】（一个人追求的目标越高，他的才力就发展的越快。） 1描述核糖体的形态结构和成分 2 简述蛋白质的合成和加工过程 3 能够利用同位素示踪法的现象和结果进行推理和判断 4简述蛋白质分选、运输 5 学会用实验资料探究结论的方法 【预习指导】完成同步训练35页的知识梳理，总结以下问题 1. 核糖体的成分、结构、功能和种类？ 2. 分泌蛋白质的合成和分泌途径？ 3. 同位素示踪法？ 4. 蛋白质的修饰加工？ 5. 真核细胞的内膜系统？ 【情景导入】展示各种面食赏心悦目的图片，它们的原料都是面粉，经过加工和包装成的，氨基酸形成各种蛋白质也是要经过加工和修饰的。 【学导结合】 一、 蛋白质的合成 （一）核糖体： 成分: 和 结构: 和