ip免疫共沉淀实验

免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤

一、原理：

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正

免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤

一、原理：

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正

免疫共沉淀 from WHU SKY

1用细胞刮子收细胞，3000rpm，5min，离心，去上清；或者弃培养基后直接用裂解液裂解细胞。从细胞裂解开始要保持低温，冰上或4度冰箱或4度离心机。

2 PBS清洗，重复步骤1

3选择合适的bufer裂解细胞，现加1000XAL（一般核质均分布的建议使用NP-40，核内分布的建议使用High Salt ，只要求拉下抗原的建议使用RIPA buffer），加入1ml Buffer (106-107个细胞)，4℃,30min（在功能旋转仪上旋转裂解）。 4 12000rpm，15min，离心取上清（若上清仍浑浊，可重复离心1-2次）50ul上清作为 Input，其它各取400ul分别加入特异性抗体和对照IgG均1ug（可根据抗体效价酌情增减），4℃,旋转2-4h，

加抗体时要计算使用相同抗体的样品数，取（N+1~2）*1ug，用小量裂解buffer

稀释，再均分到各样品中，以保证抗体加入量的一致。 5细胞裂解液和抗体孵育期间，准备Protein G（一个反应20ul纯beads，如果beads原管中液体和beads体积比是1:1，一个样品取总体积40ul，多个样品需要多取1-2个样品的beads/液体混合物）

实验一 自由沉淀实验（累积沉泥量法）

一、实验目的

本实验采用测定沉淀柱底部不同历时累计沉泥量方法，找出去除率与沉速的关系。通过本实验希望达到下述目的：

1.初步了解用累计沉泥量方法计算颗粒物杂质去除率的原理和基本实验方法。 2.加深理解沉淀的基本概念和颗粒物的沉降规律。

二、实验原理

累计沉泥量测定法的具体计算分析如下： 假定沉降颗粒具有同一形状和密度，由此得出两个关系式：

颗粒沉速us与颗粒重量m的函数关系式：

m??（us）m?au?Sb1??u1??S颗粒沉速us与颗粒数目n的函数关系式：

n??（us）n?式中,a，b，?，?是系数,与颗粒形状、密度,水的粘滞性等因素有关,其中

?，?大于1。

由以上二式可得出水样中原始悬浮物浓度C0：【重量g，数目n/mL，浓度=m×n（g/mL）】

ab????1umax0????1水中等于、大于沉速uS，的颗粒浓度为C?us：

umaxabab??????1????1???1C?us??abu?du?(u?u)?C?u?ssmaxs0sus????1????1ab?A， 令 ????1?B则：

(????1)C0C0??mdn?

实验一 自由沉淀实验（累积沉泥量法）

一、实验目的

本实验采用测定沉淀柱底部不同历时累计沉泥量方法，找出去除率与沉速的关系。通过本实验希望达到下述目的：

1.初步了解用累计沉泥量方法计算颗粒物杂质去除率的原理和基本实验方法。 2.加深理解沉淀的基本概念和颗粒物的沉降规律。

二、实验原理

累计沉泥量测定法的具体计算分析如下： 假定沉降颗粒具有同一形状和密度，由此得出两个关系式：

颗粒沉速us与颗粒重量m的函数关系式：

m??（us）m?au?Sb1??u1??S颗粒沉速us与颗粒数目n的函数关系式：

n??（us）n?式中,a，b，?，?是系数,与颗粒形状、密度,水的粘滞性等因素有关,其中

?，?大于1。

由以上二式可得出水样中原始悬浮物浓度C0：【重量g，数目n/mL，浓度=m×n（g/mL）】

ab????1umax0????1水中等于、大于沉速uS，的颗粒浓度为C?us：

umaxabab??????1????1???1C?us??abu?du?(u?u)?C?u?ssmaxs0sus????1????1ab?A， 令 ????1?B则：

(????1)C0C0??mdn?

试验二 成层沉淀和压缩沉淀实验

（一） 实验原理

该实验是研究浓度较高的悬浮颗粒的沉淀规律。沉淀过程中有明显的清水和浑水分界面，称为浑液面，浑液面缓慢下沉，直到泥沙最后完全压实为止。

颗粒间的絮凝过程越好，交界面就越清晰，清水区的悬浮物就越少。

在沉淀过程中，清水区高度逐渐增加，压实区高度也逐渐增加，而等浓度区的高度则逐渐减小，最后不复存在。变浓度区的高度开始是基本不变的，但当等浓度消失后，也就逐渐消失。变浓度区消失后，压实区仍然继续压实，直到这一区的悬浮物达到最大密度为止。当沉降达到变浓度区刚消失的位置时，称为临界沉降点(C点)。

如以交界面为纵坐标，沉淀时间为横坐标，可得交界面沉降过程曲线。曲线a-b为上凸的曲线，可解释为颗粒间的凝聚，由于颗粒凝聚变大，使下降速度逐渐变大。b-c段为直线，表明交界面等速下降。曲线c-d段为下凹的曲线，表明交界面下降速度逐渐变小。此时B区和C区已消失，C点称为沉降临界点，交界面下的浓度均大于C。c-d段表示B、C、D三区重合后，沉淀物压实的过程。随着时间的增长，压实变慢，最后压实到高度H?为止。 （二） 实验目的

1. 通过实验掌握成层沉淀和压缩沉淀的过程和规律； 2. 绘制成层沉淀和压缩沉淀的试验曲线。

实验要求

1. 时间：2014年6月22日（周日）

给排水11-1班 第1~4组：上午8：00开始

第5~8组：上午10：00开始

给排水11-2班 第1~4组：下午14：30开始

第5~8组：下午16：30开始

2. 地点：学科楼8楼给排水实验室 3. 分组要求：

每班分8小组，每组选一个组长，各班学委把分组名单发给我，邮箱：huangmei7966@163.com

4. 纪律要求：按时来实验室做实验，实行签名考勤制度；实验结束后给老师检查试验验结果、签名后方可离开。 5. 强调：（1）实验前写好预习报告，否则不能做实验。

（2）不来做实验无实验成绩。

6.实验报告包括：

实验目的、原理、方法步骤、原始数据、数据处理（并画出E-t和E-u的关系曲线）、思考题、心得体会等。

1

实验五 自由沉淀

实验项目性质：综合性 所属课程名称：排水工程 实验计划学时：3

一、 实验目的

(1)观察沉淀过程，加深对自由沉淀特点、基本概念及沉淀规律的理解。 (2)掌握颗粒自由沉淀实验的方法，求出沉淀曲线。 二、实验原理

水中的悬浮固体并非单一

实验要求

1. 时间：2014年6月22日（周日）

给排水11-1班 第1~4组：上午8：00开始

第5~8组：上午10：00开始

给排水11-2班 第1~4组：下午14：30开始

第5~8组：下午16：30开始

2. 地点：学科楼8楼给排水实验室 3. 分组要求：

每班分8小组，每组选一个组长，各班学委把分组名单发给我，邮箱：huangmei7966@163.com

4. 纪律要求：按时来实验室做实验，实行签名考勤制度；实验结束后给老师检查试验验结果、签名后方可离开。 5. 强调：（1）实验前写好预习报告，否则不能做实验。

（2）不来做实验无实验成绩。

6.实验报告包括：

实验目的、原理、方法步骤、原始数据、数据处理（并画出E-t和E-u的关系曲线）、思考题、心得体会等。

1

实验五 自由沉淀

实验项目性质：综合性 所属课程名称：排水工程 实验计划学时：3

一、 实验目的

(1)观察沉淀过程，加深对自由沉淀特点、基本概念及沉淀规律的理解。 (2)掌握颗粒自由沉淀实验的方法，求出沉淀曲线。 二、实验原理

水中的悬浮固体并非单一

实验名称：混凝沉淀实验

一、实验目的

1、通过实验观察混凝现象、加深对混凝沉淀理论的理解； 2、掌握确定最佳投药量的方法，选择和确定最佳混凝工艺条件； 3、了解影响混凝条件的相关因数。 二、实验原理

1.混凝作用原理 包括三部分：1）压缩双电层作用；2）吸附架桥作用；3）网捕作用。这三种混凝机理在水处理过程中不是各自孤立的现象，而往往是同时存在的，只不过随不同的药剂种类、投加量和水质条件而发挥作用程度不同，以某一种作用机理为主。对高分子混凝剂来说，主要以吸附架桥机理为主。而无机的金属盐混凝剂则三种作用同时存在。

胶体表面的电荷值常用电动电位ξ表示，又称为Zeta电位。一般天然水中的胶体颗粒的Zeta电位约在-30mV以上，投加混凝剂之后，只要该电位降到-15mV左右即可得到较好的混凝效果。相反，当电位降到零，往往不是最佳混凝状态。因为水中的胶体颗粒主要是带负电的粘土颗粒。胶体间存在着静电斥力，胶粒的布朗运动，胶粒表面的水化作用，使胶粒具有分散稳定性，三者中以静电斥力影响最大，若向水中投加混凝剂能提供大量的正离子，能加速胶体的凝结和沉降。

2.混凝剂 向水中投加的能使水中胶体颗粒脱稳的高价电解质，称之为“混凝剂”。混凝剂可分为无

免疫层析实验

1．原理

金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DICA）是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。本项技是将各种反应试剂分点固定在试纸条 上，检测标本加在试纸条的一端，通过毛细血管作用使样品溶液在层析材料上泳动，样本中的待测物与层析材料中的反应试剂发生特异性结合反应，形成的复合物被 富集或固定在层析条上的特定区域（检测线），通过标记免疫技术显色。本项技术的特点是可进行单份标本检测且简便、快速、不需任何仪器设备，因此，发展非常 迅速。

DICA也是GICA（goldimmunochromatography assay）GICA试剂为试纸条形式。在以塑料条上依次黏贴上以下几种组分，1--吸水纸，2--破璃纤维膜，抹上固定着干燥的金标抗体，3--硝酸纤维素膜，膜上包被着线条状抗体，4--吸水纸。

因为1，4都是吸水纸，由于吸水作用， 一，使样品液从1端向4端移动

二，当样品液达到2时，金标抗体被溶解，同时与标本中的抗原反应形成复合物 三，样品液继续移动至3 时，金标记的抗体复合物与膜上的抗体结合，呈现红色的线条

四，多余的金条抗体继