wb有毒试剂

WB试剂配方

SDS-上样缓冲液(2X) 100ml （100 mM Tris-Cl (pH 6.8)；4% (w/v) SDS；0.2% (w/v) bromophenol blue；20% (v/v) glycerol；200mM DTT (dithiothreitol) Tris-base 1.2114g

SDS 4g bromophenol blue 0.2g glycerol 20ml

ddH2O 定容至80ml 1M DTT 20ml

Store the SDS gel-loading buffer without DTT at room temperature. Add DTT from a 1 M stock just before the buffer is used.

配胶：

30%丙烯酰胺（商品化29:1） Tris-HCl：

（1）分离胶（PH8.8）1.5M

称取Tris-base（MW121.14）91.855

WB试剂配方

SDS-上样缓冲液(2X) 100ml （100 mM Tris-Cl (pH 6.8)；4% (w/v) SDS；0.2% (w/v) bromophenol blue；20% (v/v) glycerol；200mM DTT (dithiothreitol) Tris-base 1.2114g

SDS 4g bromophenol blue 0.2g glycerol 20ml

ddH2O 定容至80ml 1M DTT 20ml

Store the SDS gel-loading buffer without DTT at room temperature. Add DTT from a 1 M stock just before the buffer is used.

配胶：

30%丙烯酰胺（商品化29:1） Tris-HCl：

（1）分离胶（PH8.8）1.5M

称取Tris-base（MW121.14）91.855

山西大学化学实验教学中心

有毒有害废液及废旧化学试剂处理办法

为了实验室的安全与整洁，并控制对环境的污染，必须规范有毒有害废液及废旧化学试剂的管理，为此，特制定本办法。 一、有毒有害废液及废旧试剂的存放

实验室的废弃化学试剂和实验产生的有毒有害废液、废物，严禁向下水口倾倒或随垃圾丢弃，不可将废弃的化学试剂放在楼道、阳台、庭院等公共场合，违者将受到严格追查和处罚。有毒有害废液及废弃化学试剂应按下述规定放置： 1． 固体，一般应保存在（原）旧试剂瓶中，并注明是废弃试剂，暂存在试剂柜中。

2． 液体，化学化工学院统一购置塑料桶（分三类并印有标志）发给各化学实验室，用以分别收集含卤素有机物、一般有机物、无机物废液。废液收集桶应随时盖紧，并放于实验室较阴凉的位置。进入废液收集桶的主要有毒有害成分须在《化学废弃物记录单》上登记，要写有毒有害成分的全称或化学式，不可写简称或缩写。桶满后，将记录单粘贴在相应的桶上。

3． 有害废液不包括含剧毒试剂的废液，剧毒废液不可直接放入上述三类收集桶中，其具体处理办法见我院“关于剧毒试剂管理的补充规定”。 二、有毒有害废液及废弃试剂的消纳处理 1． 废液的回收处理

实验室的废液桶装满后，相应的实验技术人员通知实验中心，

化学试剂及有毒有害危险品的管理制度

化学试剂大多数具有一定的毒性及危险性，对其存放及使用用都必须按规定严格执行。

1、购回的试剂必须全部入库，任何人不得直接取用，入库的试剂应逐渐核实上账，分别编号并分类保管。 2、化学试剂的取用应注意如下几点：

1）化学试剂由专人领用，填写领料单，经领料人和室负责人签字后领取，并登记在案。

2）应取用与使用要求相适应的纯度等级的试剂。

3）取用过程中应注意不使试剂受污染。应用清洁的牛角勺或不锈钢小勺从试剂瓶中取出试剂。若试剂结块，应用洁净玻璃棒捣碎后取出。液体试剂应用洁净量筒倒取。从试剂内取出的没用完的剩余试剂不得倒回原瓶。

4）取用过程中应注意安全，打开易挥发试剂的瓶塞时，不可把瓶口对着人，不可用鼻子对着试剂口嗅气味。应注意试剂不得溅出。 5）取用易挥发性试剂时应在通风橱内进行，取用有毒有害试剂时应戴相应的防护用具。

3、实验室使用的化学试剂应由化分室责任人保管，定期检查使用和保管情况。化学试剂的存放应遵循科学的原则，按下列分类进行存放：1）、易燃类；2）、剧毒类；3）、强腐蚀类；4）、燃爆类；

5）、强氧化剂类；6）、放射性类；7）、低温存放类；8）、贵重类；9）指示

化学试剂及有毒有害危险品的管理制度

化学试剂大多数具有一定的毒性及危险性，对其存放及使用用都必须按规定严格执行。

1、购回的试剂必须全部入库，任何人不得直接取用，入库的试剂应逐渐核实上账，分别编号并分类保管。 2、化学试剂的取用应注意如下几点：

1）化学试剂由专人领用，填写领料单，经领料人和室负责人签字后领取，并登记在案。

2）应取用与使用要求相适应的纯度等级的试剂。

3）取用过程中应注意不使试剂受污染。应用清洁的牛角勺或不锈钢小勺从试剂瓶中取出试剂。若试剂结块，应用洁净玻璃棒捣碎后取出。液体试剂应用洁净量筒倒取。从试剂内取出的没用完的剩余试剂不得倒回原瓶。

4）取用过程中应注意安全，打开易挥发试剂的瓶塞时，不可把瓶口对着人，不可用鼻子对着试剂口嗅气味。应注意试剂不得溅出。 5）取用易挥发性试剂时应在通风橱内进行，取用有毒有害试剂时应戴相应的防护用具。

3、实验室使用的化学试剂应由化分室责任人保管，定期检查使用和保管情况。化学试剂的存放应遵循科学的原则，按下列分类进行存放：1）、易燃类；2）、剧毒类；3）、强腐蚀类；4）、燃爆类；

5）、强氧化剂类；6）、放射性类；7）、低温存放类；8）、贵重类；9）指示

Western blot 步骤： 配胶 制胶 跑胶

转移胶（转膜）

封闭和孵抗体 扫膜

一.配胶

这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

1.分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度） 2.浓缩胶

均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）

PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存

Western Blotting试验步骤

一， 组织蛋白提取

1. 准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管中，充分混合。

注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。

2. 组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀将组织建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。

注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。

3. 将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至200ulEP管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。 二， 提取液中总蛋白的测定

用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。

1. 配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体

积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小

WB步骤

WB仪器和试剂：

ELX800uv酶标仪（Bio-TEK公司） 电泳槽（Amersham Biscience公司） 转移槽（Amersham Biscience公司）

ECL发光试剂盒（Thermo公司） SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）（Beyotime） 硝酸纤维化膜（Pall Corporation） 抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司） SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（Beyotime） PBS（厂家：ORIGENE 批号：150309） 显影液(天津市汉中摄影材料厂) 定影液(天津市汉中摄影材料厂)

BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime） Western 一抗二抗去除液（Beyotime） 低温高速离心机（Eppendorf）

小鼠抗β-Actin单抗（MouseAnti—beta ActinMonoclonal Antibody） 辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（Perxidase—Conjugated Affinipure Goat Anti—RabbitIgG(H+L)）

PageRulerTMPrestained Protein Ladder（Thermo公司）

Anti—P Glycoprotei

WB 实验步骤

1. 蛋白提取，吸出培养基，用适量DPBS清洗，吸出DPBS，尽量吸干净，加入适量细胞裂解液，冰上裂解15-30min

2. 用细胞刮刀刮取皿或瓶底部的细胞，收集至1.5ml的离心管中，12000rpm离心，4度，15-30min将上清转移到新的离心管中 3. 检测蛋白浓度，定量（20-40ug），用水和蛋白上样缓冲液配成30ul以内的体积，100度变性10min，冷却后离心，上样

4. 将胶装在电泳槽内，加入1x电泳缓冲液到指定刻度，拔出梳子用注射器清洗胶孔，上样 5. 60V电压压缩蛋白至同一位置（分离胶与浓缩胶交界处），130V分离蛋白。配置转膜缓冲液，并将膜浸泡其中，4度预冷

6. 待蓝色的缓冲液条带到达距离胶底面0.5cm处即可开始转膜，按照从负极到正极海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵的顺序组装，避免产生气泡，对应正负极放入转膜槽

7. 低温转膜90min，丽春红染色，初步判定WB效果，并在对应位置将目的条带剪下来 8. 用5%的脱脂牛奶封闭，室温1小时以上，用特定的一抗4度过夜 9. 清洗一抗，用适量的TBST，室温3次，每次10min

10. 加入对应的二抗，室温孵育1小时以上，并清洗3次，同9 11. 按1:1的

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。 原理

1． SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS聚丙烯