微生物细胞的显微直接计数法

实验10 微生物的显微计数

实验十 微生物的显微计数

一、实验目的

1、明确血细胞计数板计数的原理。

2、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

二、基本原理

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液（菌悬液）置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，在显微镜下通过直接计数，测定菌悬液中微生物细胞或孢子浓度的一种方法。常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，而且基本原理相同。但后两种计菌器由于盖上盖玻片后，盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，如此法用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法直观、快速、操作简单的优点，但此法存在着测得的结果系死菌体和活菌体的总和的缺点。

本实验以血球计数板进行微生物的显微直接计数，这是显微直接计数采用

微生物学

微生物 (microorganism, microbe) 一词，是对所有形体微小、单细胞或个体结构较为简单的多细胞，甚至无细胞结构的低等生物的总称，或简单地说是对细小的、人们肉眼看不见的、只有借助于显微镜才能看见的生物的总称。但近年来发现有的细菌是肉眼可见的。

微生物特点：个体微小、结构简单、繁殖迅速、分布广泛、种类繁多、易变异 微生物的分离、纯化及培养技术

分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。 为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落并不一定保证是一种菌。

常用的分离、纯化方法： 单细胞挑取法 稀释涂布平板法 稀释混合平板法 平板划线法 稀释涂布平板法 ：

1、倒平板： 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏I号培养基，查氏培养基冷却至55-60℃时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培养基倒4皿，高氏I号培养基和查氏培养基各倒3皿。

2、制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中，在三角瓶中振摇20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml无菌水的试管中，以此类推，制成不同稀释度。 3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5

61 非无菌产品的微生物检验：微生物计数检测

简介

后面所提到的检测都是用于在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

设计这个实验旨在确定药物或制剂是否符合已建立的微生物质量要求规范。当用作上述目的时，可参考下面的说明，包括所取样品的量及以结果的解释。

该方法不适用于将微生物作为有效成分的产品。

可以运用包括自动化方法在内的替代微生物方法。但要求已被证明其等价于药典方法。

通用方法

在拟定的条件下进行试验，拟定的条件旨在避免待测产品的外在微生物污染。采取的避免污染的措施必须不影响任何测试中需要披露的微生物。

如果待测产品具有抗菌活性，尽可能取消或者解除这个活性。如果是用灭活剂，则它的效用和毒性情况必须说明。

如果表面活性物质作为检测样品，则它们对微生物的毒性和与灭活剂的兼容性应作说明。

计数方法

按照规定使用膜过滤法或者平板计数法。最可能数目法（MPN）是微生物计数法中精密度最差的方法。然而，对于特定的低生物负荷的产品组，可能是最适宜的方法。 方法的选择是基于如产品属性，微生物限度要求等因素进行选择的。 选择的方法必须进行大量的样品检测来判断是否符合规范。并建立其方法的适用性。

促生长实验，计数方法的适用性和阴性对照

实验四 酵母菌的形态观察和显微直接计数法

酵母菌是单细胞的真核微生物，个体比细菌大得 多，细胞核与细胞质已有明显的分化。繁殖方式 也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵 母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产 生子囊孢子。 酵母菌的形态通常有球状、卵园状、椭圆状、柱 状或香肠状等多种。

Saccharomyces cerevisiae

本实验通过用美蓝染色制成水浸片来观察生活的 酵母形态和出芽生殖方式，区分死、活细胞。 美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的， 而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行 染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具 有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变 为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对 于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还 原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡 蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形 态，还可以区分死、活细胞。

一、实验目的和内容目的：了解酵母菌及其形态结构。内容：观察酵母菌个体形态、出芽方式，并区分 死、活细胞。

二、实验材料和用具

酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae) 斜面菌 种。 0.05%美蓝染色液； 显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接

微生物细胞工程的应用

1.7 微生物细胞工程的应用1.7.1 通过原核微生物生产商品 1.7.2 现代生物农药 1.7.3 现代微生物肥料 1.7.4 生物净化与生物废料再生 1.7.5 微生物细胞固定技术

微生物细胞工程的应用

1.7.1 通过原核微生物生产商品将原核微生物改造成生产有用代谢产物的反应 将原核微生物改造成生产有用代谢产物的反应 器，生产许多重要的生物产品 细胞工程技术+基因工程技术， 细胞工程技术 基因工程技术，克隆生物产品 基因工程技术 的编码基因，在宿主细胞中进行表达。 的编码基因，在宿主细胞中进行表达。 降低成本，提高药效、 降低成本，提高药效、产量

微生物细胞工程的应用

技术策略目的基因的获得：基因组 文库， 目的基因的获得：基因组DNA文库，cDNA 文库 文库， 扩增， 文库，PCR扩增，化学合成法 扩增DNA/RNA提取，酶解，转化 提取，酶解， 提取 目的DNA的筛选：制作探针，从基因组 的筛选： 目的 的筛选 制作探针，从基因组DNA文 文 库或cDNA文库中筛选出目的 文库中筛选出目的DNA 库或 文库中筛选出目的探针制备：根据同源序列 纯化目的蛋白 纯化目的蛋白， 探针制备：根据同源序列/纯化目的蛋白，测定其氨

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第五章 微生物的营养

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本章内容第一节，微生物的化学组成和营养要求

第二节，微生物的营养类型

第三节，营养物质进入细胞的方式第四节，培养基

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第一节 微生物细胞的化学组成和营养要求一、微生物细胞的化学组成水(70%-90%) 微生物细胞 干物质 有机物 蛋白质、多糖、 脂、核酸、维生 素、有机酸等及 其降解产物 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性” 无机物(盐)

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细胞化学元素组成：

主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫 、钾、镁、钙、铁； 微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。

这些化学元素都来自胞外环境。

微生物细胞利用这些化学元素物质制造其细胞物质和组 分，并进一步将它们组织成为细胞结构。

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营养：微生物在其生长过程中获取生命活动所需的能量和结构 物质的生理过程。

营养物质：外界环境可为细胞提供结构组分、能量、代谢调节物质 和良好生长环境的化学物质。

概念区分：营养物质是微生物生存的物质基础，而营养是生物维持 和延续其生命形式的一种生理过程。

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二、微生物的营养要素及其生理功能微生物

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实验四、 实验四、真菌的显微形态观察及 微生物菌落形态观察

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一、实验目的 掌握真菌水浸片的制作 显微观察丝状真菌和酵母菌的形态 比较细菌、真菌和放线菌的菌落形态 比较细菌、

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二、实验材料和菌种1.器材： 1.器材 器材： 接种针、滴管、载玻片、盖玻片、酒精灯、 接种针、滴管、载玻片、盖玻片、酒精灯、显微镜 2.菌种： 2.菌种 菌种： 曲霉、根霉、犁头霉、青霉 曲霉、根霉、犁头霉、 酿酒酵母、红酵母 酿酒酵母、 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、 放线菌 放线菌507(平板一套可打开用于显微观察，一套不用打开用于菌落形态 平板一套可打开用于显微观察， 观察) 观察)

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三、实验内容(一)丝状真菌及酵母显微形态观察1、实验目的要求 学习并掌握水浸片法制备标本片的方法 观察根霉、黑曲霉、 观察根霉、黑曲霉、犁头霉和青霉的菌丝形态 及特征 观察酵母菌的形态

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2、实验原理 真菌形态结构比细菌复杂。习惯上， 真菌形态结构比细菌复杂。习惯上， 真菌可分为酵母菌和霉菌。 真菌可分为酵母菌和霉菌。 霉菌由粗大、 霉菌由粗大、有隔或无隔分支状菌丝

实验一 光学显微镜的使用与微生物观察

第一节 普通光学显微镜的使用 一、实验目的

1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。

2、学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。 3、在油镜下观察微生物的几种基本形态。 二、基本原理

（一）普通光学显微镜的构造

普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图1-1）。 1、机械系统

机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。 （1）镜座：它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。 （2）镜臂：用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。

（3）镜筒：它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。镜筒长度一般固定，通常是160mm。有些显微镜的镜筒长度可以调节。

（4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜。为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜。转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。

（5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；

实验一 光学显微镜的使用与微生物观察

第一节 普通光学显微镜的使用 一、实验目的

1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。

2、学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。 3、在油镜下观察微生物的几种基本形态。 二、基本原理

（一）普通光学显微镜的构造

普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图1-1）。 1、机械系统

机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。 （1）镜座：它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。 （2）镜臂：用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。

（3）镜筒：它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。镜筒长度一般固定，通常是160mm。有些显微镜的镜筒长度可以调节。

（4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜。为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜。转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。

（5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；

实验五 微生物的计数与活性污泥中生物相观察

一、 实验目的

1、学习平板菌落计数法的基本原理和方法，了解血球计数板的结构和使用方法和分光光度法计数法的原理和方法。 2、学会用血球计数板对芽殖酵母进行计算。

3、学习观察活性污泥中生物相的方法，初步分析生物处理系统工作状态是否正常。

二、 实验原理

1、 平板菌落计数法

平板菌落计数法是将待测样品经适当的稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据稀释倍数和取样接种量即可算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不容易完全分散成单个细胞，所以长成的一个单个菌落也有可能来自样品中的2—3个或者更多细胞。因此平板菌落结果往往偏低。为了清楚阐述平板菌落计数结果，现在已倾向使用菌落形成单位，而不以绝对的菌落数来表示样品的活菌含量。 2、 分光光度法

当光线通过细菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，菌细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出。因此，可用一系列己知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度--菌数