CHO细胞的培养方式

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摘要

CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞。微载体细胞培养开始于19世纪60年代末期，最早使用离子交换凝胶（DEAE-Sephadex A50）作为载体，轻微搅动即可悬浮在培养基中。由于这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖。载体处于悬浮状态时，这样既可大大增加细胞附着面积，又使细胞能与培养基充分接触，进而有利于细胞的生长，因此能达到大量培养细胞的目的。后来根据细胞附着生长的特点，对微载体进行改良，使其电荷或其介质更利于细胞附着和生长。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面，1 g 微载体其比表面积可达6000 cm2，从而可实现细胞的高密度培养。首先将CHO细胞在无血清培养基（SAF-CHO-G-004）中进行无血清驯化。其次将CHO细胞（成功用无血清驯化后的细胞）用0.25%胰酶消化制成细胞悬液后，沿导流管加入含明胶微载体和SAF-CHO-G-004细胞培养基的WhcltonBioster瓶罐中连续培养生成一定量的种子细胞。最后将种子细胞进行大规模

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（４）：５３～５８

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（广州铭康生物工程有限公司　广州　５１０７３０）

技术与方法

　　利用搅拌式生物反应器进行批次或批次—补料的规模化细胞培养，是当前生产基因工程药物的主要方式。随着工程化单克隆抗体的出现和应用的日益广泛，原来的生产工艺已成为阻碍产量迅猛增长的瓶

１］

颈［，改用连续灌流的培养方式已越来越受到重视。

因为它在节省设备投资和提高生产效率等方面有着明

２］显的优势［。为了方便地实现灌流培养中的细胞截

留，最常用的方法是采用微载体培养，并通过过滤或沉降的方法使细胞和培养基分离。但微载体本身价格昂贵，成本高，操作及处理复杂，为此，采用细胞的结团培

３，４］

。养已开始引起人们的兴趣［

　　如何使细胞迅速地、良好地结团，以及如何能长期截留细胞进行灌流培养是能否将结团培养工艺真正用于规模化生产的关键。本试验中，我们既利用了ＣＨＯ细胞在培养中能自然结团的能力，又设计了一套超

５］

声—沉降柱二合一的灌流系统，已申请发明专利［，它

不仅可以进一步促进细胞结团，而且能有效地截留细胞进行长期灌流培养，试验结果令人满意。

收稿日期：２００８０１０８　　修回日期：２００８

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（４）：５３～５８

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（广州铭康生物工程有限公司　广州　５１０７３０）

技术与方法

　　利用搅拌式生物反应器进行批次或批次—补料的规模化细胞培养，是当前生产基因工程药物的主要方式。随着工程化单克隆抗体的出现和应用的日益广泛，原来的生产工艺已成为阻碍产量迅猛增长的瓶

１］

颈［，改用连续灌流的培养方式已越来越受到重视。

因为它在节省设备投资和提高生产效率等方面有着明

２］显的优势［。为了方便地实现灌流培养中的细胞截

留，最常用的方法是采用微载体培养，并通过过滤或沉降的方法使细胞和培养基分离。但微载体本身价格昂贵，成本高，操作及处理复杂，为此，采用细胞的结团培

３，４］

。养已开始引起人们的兴趣［

　　如何使细胞迅速地、良好地结团，以及如何能长期截留细胞进行灌流培养是能否将结团培养工艺真正用于规模化生产的关键。本试验中，我们既利用了ＣＨＯ细胞在培养中能自然结团的能力，又设计了一套超

５］

声—沉降柱二合一的灌流系统，已申请发明专利［，它

不仅可以进一步促进细胞结团，而且能有效地截留细胞进行长期灌流培养，试验结果令人满意。

收稿日期：２００８０１０８　　修回日期：２００８

利用CHO细胞生产重组乙肝疫苗,在细胞培养收换液工艺中建立管道化生产线。采用大罐配成新鲜工作液,过滤除菌,经管道直接输入细胞培养瓶内;细胞培养上清的收集也经管道或直接倒入不锈钢罐内。工艺改进后,细胞原液收获率提高15%,配液污染率降低12%,同时降低了成本。

维普资讯

第 l第 4期：7 2卷 320 0 2年 8月

生

物

技

术

V0 . 2. 1 1 No. 3 4: 7Au 2O 2 g. O

BI r a ECH N0I GY J

3 1讨论：面喷施 D A,是对棉花施加外源 D A。现蕾期 .叶 N就 N

分和地下部分)是棉花生长发育的转折时期，植株开始加快生长(包括地上部,

高核酸的代谢水平D A可为复制新基因提供足够的原材料，殖生长，此时喷施 N,提,

对养分的吸收能力增强，养生长远远旺于生营

有利于各种酶的合成以及赤霉素 ( A、 G )生长素 (从 ) I的生成和细胞分裂素 ( l含量的增加【,从而加速 C( ) 4 j细胞的分裂代谢，快植株根、、的生长和促进花芽的分加茎叶化，为中后期旺盛的生殖生长打下物质基础。 棉花进入盛花期，面积指数已达到最大值，养生长减叶营弱，而生殖生长居于优势，植株生长、花受精及花铃发育均需开消耗大量有机养料，养生长和生

昆虫细胞培养及其应用进展

摘 要: 随着生命科学的迅速发展, 细胞工程愈来愈受到人们的重视。以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值, 已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。本文综述了有关昆虫细胞培养的研究进展, 包括昆虫细胞培养基研究开发, 昆虫细胞系的建立和组织培养, 利用生物反应器大规模培养昆虫细胞, 昆虫细胞2杆状病毒表达系统,构建基因工程细胞系及其稳定性表达, 以及昆虫细胞培养的应用前景和研究展望。 关键词: 昆虫细胞系; 昆虫细胞培养; 基因表达;培养条件

昆虫的组织培养最早始于 1915 年, 直到1962 年 Grace 才成功建立了世界上第一个细胞系, 此后昆虫细胞培养在世界范围内广泛开展, 不断有新细胞系建立的报道。现在, 昆虫细胞培养已在细胞生物学、分子生物学、昆虫学、病毒学、生物化学、遗传学等领域的研究工作中发挥着重要的作用。 1 昆虫细胞培养基

昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段. 天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液. 合成培养基最大的特点是各种成分已知.无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上, 在基

Hela细胞传代培养操作步骤

1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。 2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。

3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。

4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。 5．取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。（加versene主要是为了将旧培养基洗去）。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。 7．打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。

8．将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中

昆虫细胞培养及其应用进展

摘 要: 随着生命科学的迅速发展, 细胞工程愈来愈受到人们的重视。以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值, 已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。本文综述了有关昆虫细胞培养的研究进展, 包括昆虫细胞培养基研究开发, 昆虫细胞系的建立和组织培养, 利用生物反应器大规模培养昆虫细胞, 昆虫细胞2杆状病毒表达系统,构建基因工程细胞系及其稳定性表达, 以及昆虫细胞培养的应用前景和研究展望。 关键词: 昆虫细胞系; 昆虫细胞培养; 基因表达;培养条件

昆虫的组织培养最早始于 1915 年, 直到1962 年 Grace 才成功建立了世界上第一个细胞系, 此后昆虫细胞培养在世界范围内广泛开展, 不断有新细胞系建立的报道。现在, 昆虫细胞培养已在细胞生物学、分子生物学、昆虫学、病毒学、生物化学、遗传学等领域的研究工作中发挥着重要的作用。 1 昆虫细胞培养基

昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段. 天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液. 合成培养基最大的特点是各种成分已知.无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上, 在基

昆虫细胞培养及其应用进展

摘 要: 随着生命科学的迅速发展, 细胞工程愈来愈受到人们的重视。以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值, 已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。本文综述了有关昆虫细胞培养的研究进展, 包括昆虫细胞培养基研究开发, 昆虫细胞系的建立和组织培养, 利用生物反应器大规模培养昆虫细胞, 昆虫细胞2杆状病毒表达系统,构建基因工程细胞系及其稳定性表达, 以及昆虫细胞培养的应用前景和研究展望。 关键词: 昆虫细胞系; 昆虫细胞培养; 基因表达;培养条件

昆虫的组织培养最早始于 1915 年, 直到1962 年 Grace 才成功建立了世界上第一个细胞系, 此后昆虫细胞培养在世界范围内广泛开展, 不断有新细胞系建立的报道。现在, 昆虫细胞培养已在细胞生物学、分子生物学、昆虫学、病毒学、生物化学、遗传学等领域的研究工作中发挥着重要的作用。 1 昆虫细胞培养基

昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段. 天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液. 合成培养基最大的特点是各种成分已知.无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上, 在基

内皮细胞的培养

内皮细胞，用高倍镜观察肠系膜上的毛细血管，可见到内皮细胞，内皮细胞较间皮细胞小，排列紧密。内皮细胞或血管内皮是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组成，呈多边形，细胞的边缘呈锯齿状，相互嵌合。血管内皮细胞（EC）位于血液与血管组织之间，它不仅能完成血液和组织液的代谢交换，并且能合成和分泌多种生物活性物质，以保证血管正常的收缩和舒张，起到维持血管张力，调节血压以及凝血与抗凝平衡等特殊功能，进而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。抗凝血材料表面内皮细胞化，可以减少血栓的形成和血小板激活。

下面以脐带静脉为例介绍内皮细胞的培养： 一、试剂准备：

（1）脐带保存液：生理盐水、葡萄糖100 mmoL/L、100 U/ml青霉素一100 U/m1链霉素。 （2）组织消化液：0．1％ I型胶原酶和0．05％胰酶-0．02％ 乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液。

（3）内皮细胞培养液：含20％胎牛血清、ECGS、肝素，100 U／m1青霉素-100 U／m1链霉素的M199培养基。

（4）器皿：0．2％ 明胶包被：用PBS配制。

二、原代提取

（1）脐带处理：在无菌条件下取新生胎儿脐带，长度>20 cm。剪去脐带两端和脐带上有夹痕及血肿部分

AEP对LPS诱导的Raw264.7细胞炎症模型抗炎实验

一、试剂与仪器 （一）细胞系 RAW264.7。 （二）试剂 胎牛血清

DMEM HyClone，美国 10000 U/mL 青霉素/链霉素Gibco，美国

DMSO Sigma，美国 lipopolsaccharide Sigma，美国 甲基四唑蓝(MTT) Sigma，美国 对氨基苯磺酸 Sigma，美国 N-α-萘乙二胺 Sigma，美国 （三）仪器 超净台 酶标仪

CO2恒温细胞培养箱 显微镜 离心机

（四）供试品配置

LPS 溶液配置：称取 LPS 粉末 5 mg，溶于 1 mL DMSO 中，得 5 mg/mL 母液。用时将母液用培养基稀释至 2 μg/mL（DMSO＜0.1%）。

MTT 溶液配置：称取 MTT 50 mg，溶于 10 mL PBS