蛋白酶产生菌的筛选

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

蛋白酶产生菌的筛选

组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：***

一、实验目的

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

学习从自然界中分离蛋白酶产生菌

二、实验内容

蛋白酶产生菌的分离

三、实验原理

许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。

四、实验材料和用具

1.材料：土壤样品

2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL

无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、

3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇

床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

五、操作步骤

（一） 配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，

琼脂 1.5～

弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究

维普资讯

浙江大学学报 (农业与生命科学版) 2(:9 6,0 91 5 4 2 3 )~ 0J u n lo e in ie st ( o r a fZh ja g Un v riy Agrc i.& Li c. f S i) e

文章编号： 0 89 0 ( 0 3 0—0 90 1 0— 2 9 2 0 ) 10 5— 6

弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究陈启和，国庆，应龙何邬(江大学食品科学与营养系，浙江杭州 3 0 2 )浙 1 0 9

摘要：从肉联厂和屠宰场附近的土壤和污水中采集到的近 1 0个样品中，富集培养分离到 1 3株 0经 2能产生弹性蛋白酶的菌株，复初筛、筛后，离到一株产胞外弹性蛋白酶活较高且稳定的细菌，初反复分经

步鉴定属芽孢杆菌属 ( a iu p L3 .同时研究了其产酶最适条件，产酶最适碳源为葡萄糖，最适 B c lss .E ) l氮源为豆饼粉 .对碳源、源和生长因子进行了正交实验，究发现碳源对产酶的影响最大，次为氮并氮研其

源 .当葡萄糖的用量为 6、饼粉为 5、米提取液为 0 2时，具有较高的产酶水平 .最适发酵初 豆 玉 .其

始 p为 7

弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究

维普资讯

浙江大学学报 (农业与生命科学版) 2(:9 6,0 91 5 4 2 3 )~ 0J u n lo e in ie st ( o r a fZh ja g Un v riy Agrc i.& Li c. f S i) e

文章编号： 0 89 0 ( 0 3 0—0 90 1 0— 2 9 2 0 ) 10 5— 6

弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究陈启和，国庆，应龙何邬(江大学食品科学与营养系，浙江杭州 3 0 2 )浙 1 0 9

摘要：从肉联厂和屠宰场附近的土壤和污水中采集到的近 1 0个样品中，富集培养分离到 1 3株 0经 2能产生弹性蛋白酶的菌株，复初筛、筛后，离到一株产胞外弹性蛋白酶活较高且稳定的细菌，初反复分经

步鉴定属芽孢杆菌属 ( a iu p L3 .同时研究了其产酶最适条件，产酶最适碳源为葡萄糖，最适 B c lss .E ) l氮源为豆饼粉 .对碳源、源和生长因子进行了正交实验，究发现碳源对产酶的影响最大，次为氮并氮研其

源 .当葡萄糖的用量为 6、饼粉为 5、米提取液为 0 2时，具有较高的产酶水平 .最适发酵初 豆 玉 .其

始 p为 7

蛋白酶产生菌的紫外诱变育种

xxxx大学生命科学学院 生物工程 第一组

前言: 因为自发突变率小， 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是紫外，紫外诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。 本次实验通过比较对照组和紫外诱变1min、5min、10min的实验组菌落的生长情况和水解圈的情况，可以很好的了解紫外诱变的效果。初步的说明诱变育种为筛选高效，稳定的菌种提供了有效可能的方法。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品：老师提供的生长较好的菌液 1.1.2培养基及其配制

1）液体培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨 1.0g，NaCl 1.0g，pH7.0～7.5，H2O 定容至100ml。配好50ml/三角瓶，分装两瓶每瓶50ml.包扎112℃，灭菌 30min。

2）固体培养基（300ml）:牛肉膏0.9g，蛋白胨3g，NaCl 3g， H2O 定容300ml，

蛋白酶产生菌的紫外诱变育种

xxxx大学生命科学学院 生物工程 第一组

前言: 因为自发突变率小， 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是紫外，紫外诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。 本次实验通过比较对照组和紫外诱变1min、5min、10min的实验组菌落的生长情况和水解圈的情况，可以很好的了解紫外诱变的效果。初步的说明诱变育种为筛选高效，稳定的菌种提供了有效可能的方法。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品：老师提供的生长较好的菌液 1.1.2培养基及其配制

1）液体培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨 1.0g，NaCl 1.0g，pH7.0～7.5，H2O 定容至100ml。配好50ml/三角瓶，分装两瓶每瓶50ml.包扎112℃，灭菌 30min。

2）固体培养基（300ml）:牛肉膏0.9g，蛋白胨3g，NaCl 3g， H2O 定容300ml，

２００９年１９（２）

生物技术５１

用酪蛋白平板初筛和发酵脱胶复筛对脱胶细菌进行筛选，有效地缩小了目的菌的筛选范围，得到了一株可明显降低原料残胶率的细菌Ｄ７，处理后原料残胶率将为５．１２％。我们又对其个体形态与菌落形态、生理生化特征１６ＳｒＤＮＡ序列进行了分析，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株Ｄ７进行分类鉴定。结果表明菌株所为芽孢杆菌，

［４］张海霞．绢纺原料的微生物脱胶处理技术［Ｄ］．上海：东华大学硕士学位论文，２００５：１３．

【５］李志忠，蒋少军．蚕丝蛋白酶精练工艺的理论与实践【Ｊ］．染整技术，２００６．２８（４）：１３—１５．

［６］中国纺织大学绢纺教研室．绢纺学（上册）［Ｍ］．北京：纺织工业出版

社，１９８５：１０７—１０８．

［７］ＲＥ布坎南，ＮＥ吉本斯．中圃科学院微生物研究所＜伯杰氏细菌签定手册）翻译组译．伯杰氏细菌鉴定手册［Ｍ］．３版．北京：科学出版社。

１９８４．

与腊样芽孢杆菌（励诎岱删）的同源性最高，属于腊样芽孢

杆菌类。所最适生长温度３７℃左右，最适生长ｐＨ６。５—７。５，可根据菌株Ｄ７生长的环境条件设定发酵工艺参数。该脱胶菌的获得为研究蚕丝微生物纯种发酵脱胶奠定基础。

参考文献：

［１］萤炳荣．绢纺织［Ｍ］．北京：

２００９年１９（２）

生物技术５１

用酪蛋白平板初筛和发酵脱胶复筛对脱胶细菌进行筛选，有效地缩小了目的菌的筛选范围，得到了一株可明显降低原料残胶率的细菌Ｄ７，处理后原料残胶率将为５．１２％。我们又对其个体形态与菌落形态、生理生化特征１６ＳｒＤＮＡ序列进行了分析，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株Ｄ７进行分类鉴定。结果表明菌株所为芽孢杆菌，

［４］张海霞．绢纺原料的微生物脱胶处理技术［Ｄ］．上海：东华大学硕士学位论文，２００５：１３．

【５］李志忠，蒋少军．蚕丝蛋白酶精练工艺的理论与实践【Ｊ］．染整技术，２００６．２８（４）：１３—１５．

［６］中国纺织大学绢纺教研室．绢纺学（上册）［Ｍ］．北京：纺织工业出版

社，１９８５：１０７—１０８．

［７］ＲＥ布坎南，ＮＥ吉本斯．中圃科学院微生物研究所＜伯杰氏细菌签定手册）翻译组译．伯杰氏细菌鉴定手册［Ｍ］．３版．北京：科学出版社。

１９８４．

与腊样芽孢杆菌（励诎岱删）的同源性最高，属于腊样芽孢

杆菌类。所最适生长温度３７℃左右，最适生长ｐＨ６。５—７。５，可根据菌株Ｄ７生长的环境条件设定发酵工艺参数。该脱胶菌的获得为研究蚕丝微生物纯种发酵脱胶奠定基础。

参考文献：

［１］萤炳荣．绢纺织［Ｍ］．北京：

实验3 漆酶产生菌的筛选

1. 实验原理：

菌种筛选包括分离、初筛和复筛等几个步骤，挑选具有某种能力的有用菌种，根据不同的筛选目的，采用不同的筛选路线。

白腐菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，被认为是最主要的木质素降解微生物。木质素降解酶系主要包括三部份: 木质素过氧化物酶(Lip）、锰过氧化物酶(MnP)以及漆酶( Lac)。由于漆酶能把分子氧直接还原为水，与其他木质素降解酶相比，具有更大的实际应用价值。漆酶是一种含铜多酚氧化酶，分子量在64-390kD之间。由于漆酶具有氧化与木质素有关的酚类和非酚类化合物以及高度难降解环境污染物的能力, 因此在食品工业、制浆和造纸工业、纺织工业、土壤的生物修复等领域具有广泛的应用前景，因此筛选高产漆酶的白腐菌显得至关重要。

由于木质素结构的复杂性，可选用木质素类典型化合物，如单聚物香草酸、愈创木酚、苯酚、磷甲基苯酚；二聚物愈创木基甘油-B-松柏醇醚(GGE）、脱氢联松柏醇(DCA), 1,2-二愈创木基丙烷-1,3-二醇等。可选用相对便宜的愈创木酚为唯一碳源的选择性培养基，从土壤中分离就可以筛选出产漆酶的木质素降解菌。漆酶可以使无色的愈创木酚氧化为褐色，因此愈创木酚平板可以作为漆酶的筛选平板。

对于白腐菌来

蛋白酶酶切位点

蛋白酶的分类及作用位点 蛋白酶 氨基肽酶 菠萝蛋白酶 羧肽酶A 羧肽酶B 羧肽酶Y 分类 金属蛋白酶 巯基蛋白酶 锌金属蛋白酶 锌金属蛋白酶 丝氨酸羧肽酶 作用位点 已知抑制物 带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；2，2，双吡啶，1．1()-菲咯啉 不分解由X-Pro、D或Q组成的肽键 无特异性 α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化 带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端；EDTA，EGTA 不能分解R、P或羟脯氨酸 K- Lys，R- Arg羧基端 氨基酸羧基端 EDTA，EGTA，碱性氨基酸 PMSF 组织蛋白酶C 琉基蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 胶原酶 dispase 金属蛋白酶 金属蛋白酶 氨基端双肽，可通过K，R或P氨基醋酸碘， 甲醛 端作为第二或第三个氨基酸封闭 在F- Phe,T- Thr或Y- Tyr之后 在P-X-G-P肽链中X之后 无特异性 在R- Arg之后 在E- Glu/Gln或D- Asp之后 在K- Lys之后 在D-D-D-D-K-肽链中K之后 在R- Arg之后 无特异性 在一些R- Arg之后 抑肽酶,PMSF,TPCK,α-巨球蛋白 EDTA,EGTA,还原剂,但无血清

蛋白酶酶切位点

蛋白酶的分类及作用位点 蛋白酶 氨基肽酶 菠萝蛋白酶 羧肽酶A 羧肽酶B 羧肽酶Y 分类 金属蛋白酶 巯基蛋白酶 锌金属蛋白酶 锌金属蛋白酶 丝氨酸羧肽酶 作用位点 已知抑制物 带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；2，2，双吡啶，1．1()-菲咯啉 不分解由X-Pro、D或Q组成的肽键 无特异性 α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化 带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端；EDTA，EGTA 不能分解R、P或羟脯氨酸 K- Lys，R- Arg羧基端 氨基酸羧基端 EDTA，EGTA，碱性氨基酸 PMSF 组织蛋白酶C 琉基蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 胶原酶 dispase 金属蛋白酶 金属蛋白酶 氨基端双肽，可通过K，R或P氨基醋酸碘， 甲醛 端作为第二或第三个氨基酸封闭 在F- Phe,T- Thr或Y- Tyr之后 在P-X-G-P肽链中X之后 无特异性 在R- Arg之后 在E- Glu/Gln或D- Asp之后 在K- Lys之后 在D-D-D-D-K-肽链中K之后 在R- Arg之后 无特异性 在一些R- Arg之后 抑肽酶,PMSF,TPCK,α-巨球蛋白 EDTA,EGTA,还原剂,但无血清