载体构建的原理及方法

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而

真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段

（4） P/E 启动子/增强子

（5）Terms 终止信号

（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

1 / 1文档可自由编辑

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位

一、目的基因的a(4.2k) PCR

1、PCR体系（引物ath-a-4.2k-F ath-a-4.2k-R 酶 fusion聚合酶 体积单位 μ l） DNA fusion 5*fusionHF 2.5mM F R ddH2O Buffer dNTP 2 *3 0.25 0.75 4 12 2 6 0.5 1.5 0.5 1.5 10.75 32.75 totle 20 60 98°C 30s 98°C 15s 56°C 30s 72°C 4min30s 72°C10min 16°C∝ 30cycle

（注：聚合酶说明：fusion聚合酶是高保真聚合酶，扩增片段为平末端） 2、跑胶

1％琼脂糖凝胶胶跑20min，观察实验结果。 3、胶回收（试剂盒回收） （1）、在紫外光下将扩增条带用刀切下，要尽量快（紫外会诱导基因突变）放在1.5mL的离心管中；（注意：刀头尽量伸进离心管内部，防止污染离心管外部可接触部位） （2）、在离心管中加入300-400μ l的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C水浴锅加热溶解直至透明； （3）、加0.5倍Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。 （4）、吸取步骤3

关于表达载体的构建

1. 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类

载体既有复制子，更要有强启动子； 2. 大肠杆菌中的表达载体应含有 （1）强启动子

（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。

（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。

我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。

3. 载体构建的步骤 （1）.设计引物

1.引物的长度 用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。 2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

3. Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则

载体构建 目的基因克隆引物设计PCR质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养挑菌并菌液PCR上述菌液PCR有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用）

取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）

依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）

反应所需试剂 体积（单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液

载体构建 目的基因克隆引物设计PCR质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养挑菌并菌液PCR上述菌液PCR有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用）

取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）

依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）

反应所需试剂 体积（单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液

SOPS标准作业程序体系的设计原理及构建方法

一、 SOPS的定义

SOPS是Standard Operation Procedure System四个单词中首字母的大写，即标准作业程序体系，就是将某一“过程”的标准操作步骤、过程接口和管控要求以统一的格式描述出来，用来指导和规范日常的工作。

透过SOPS的定义可清晰地看出，SOPS几乎集成了对“过程”的所有管控要求，表现形式及使用方法简单、直观、易懂，是现场看板管理的具体体现，是岗位人员快速获取操作依据的有效工具和方法。

SOPS是在SOP的基础上通过引入管理的系统方法而提出的一种全新运用方法。从设计理念和方法来看，SOP确实理顺了作为单个流程内部纵向间有关接口和要求等问题，但从企业整体运营的系统角度来看，由于存在不同功能、不同层次的过程，并以纵横交错的网状方式连接而成的复杂系统，各过程之间有着相互影响和相互制约互补的关系。这些过程运营除了存在过程自身接口关系外，还存在过程与过程间的外部接口关系，诸多时候正是因为这些接口和职责交叉，导致扯皮、推诿和管理盲区等现象。所以SOP仅属于是“只见树木、不见森林”的范畴，还不能从根本上解决企业的整体运行效率问题。而对于SOPS标准作业程序体系的提出

脂联素

H nij n ln cn eeo g aA ig ic il am eS4

a d VeeayMei ie n it r rcn dn

N 2 0 9 o1 2 0

脂牛素基因联真核表达体载构建的及鉴定黄海龙 王，哲 于健国孙，,佳 (吉.大学林畜牧兽医学院，1吉长林春10;.63022林吉农业大学动科学技物术院，学吉林长春10 1 3)18 图分中号类 8: 32￥文献标识码： 文章编A号：40 04—2 02— )0—43 10 73 0(9 1 000

关键词：;牛脂联素基因；真核表达载摘体：要了构建脂联牛素基真核表达载体因，为试验采用 RT— P方法扩增R牛脂联素 o(iae iC b vd— n pcnB vnD 基N因 o,e t oA, P i)将其克隆到p 1 M D一8T体载中，正序的质确粒经 Eo I和 N测 ctR Io双酶 ,切回收目基的片因将段定其向克隆到pIZ tC o A载体P中，建重质粒组p Z￣I oA P结果表。构 P C Bo vDN A明：克隆基因的序与 G n列 ka Be n布的公序有 10列 0%同源性的；目的基因向正插入，阅读框正确无误 ,说牛明脂联素基因真核表达载体构建功成。C

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体(SLC7a8)基因cDNA的读码框(CDS),构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠(wistar-kyoto,WKY)肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质

第 41卷第 6期 2 01 1年 1 1月

温

州

医

学

院

学

报

Vo1 . . No 6 41No 2 v. 011

J u na f W e z o e i a le e o r l o n h u M d c lCo l g

■大鼠 S C a基因的克隆及真核表达载体的构建 L T8王本极，黄晓燕，林素，周希，戴晓春，方俊旭，杨德业( . JJ 1温，医学院附属第一医院心内科，温州医学院心血管生物和基因研究所，浙江温Jl 3 5 0 i、 i 200、2温州医学院 .眼视光学院，浙江温州 3 5 0 ) 2 0 0

■

[摘

要]目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体 (L 78 SCa )基因eN

ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１１（５）：６９－７２Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ２０１０，ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨＡＡＳ．Ａｌｌｒｉｇｈｔｓｒｅｓｅｒｖｅｄ．

ＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ

ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＲＮＡｉＶｅｃｔｏｒＷｈｉｃｈＲｅｓｉｓｔＣｕｃｕｍｂｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓａｎｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＴｏｂａｃｃｏ

ＺＨＡＮＧＹｕ，ＺＨＥＮＧＹｉｎｙｉｎｇ，ＺＨＡＯＦｅｎｇｙｕ，ＱＩＡＯＹａｈｏｎｇ，ＣＵＩＢａｉｍｉｎｇ，ＸＩＡＮＧＢｅｎｃｈｕｎ

ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｒｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２００３

Ａｂｓｔｒａｃｔ　［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＡｉｍｅｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓａｎｄｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｈｉｓｖｅｃｔｏｒｉｎｔｏｔｏｂａｃｃｏ．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＲＴＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏａ

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