rt-pcr核酸检测

虽然Real-time PCR（实时荧光定量PCR）和Reverse transcription PCR（反转录PCR）看起来都可以缩写为RT-PCR，但是，国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为qPCR（quantitative real-time PCR）。

更正楼主的观点：qPCR不一定与反转录相关，除了可以用cDNA作为模板，也可以用基因组DNA等作为模板。而反转录PCR也不一定非要与荧光定量相关，从mRNA中反转录得到cDNA，然后PCR扩增出目的基因，这也是反转录PCR。

综上，那RT-qPCR（也有人写成qRT-PCR）就很好理解了，就是结合了荧光定量技术的反转录PCR：先从RNA反转录得到cDNA（RT），然后用Real-time PCR进行定量分析（qPCR）。 有兴趣的话可以看看维基百科：

http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is a varia

RT-PCR

注意：酶现拿现用，用完放回—20度

先配后加，节约枪头

试剂用前弹一下，再甩一下，再用；每次加液也是如此

一、DNase处理：

1、10ul 体系

Total RNA 1ug（或者2ug）A ul

10*buffer （含Mgcl2 ）1ul

DNase（1U/ul）1ul

DEPC free water补足总体积10ul即为8-A ul

总体积：10ul

37℃，30分钟即DnaseⅠ

2、加入25mM的EDTA（终止DNA酶活性）1ul，（可以不加，无太大影响）

65℃，10min，即DnaseⅡ

备注：这一步后，共有11 ul的产物，取10ul进行一下的步骤，留取1ul作为对照，将这个1ul的留样用1ul的水稀释。

二、逆转录

（以下为20ul的体系，如果样品过多，或者不同体系可以等比加样）

1、加入，并混匀

1)总RNA（含有1-2ugRNA，或者是10ul的第一步中经过DNase处理的总RNA）

10ul

2)Primer oligo（dt）18 （0.5ug/uL）1ul

3)dNTP（10mM）1ul

总体积：12ul 65℃，5min，立即取出放置在冰上（保持开链状态）即程序cDNAⅠ

2、加入，并混匀

5 x first brand buffer 4ul

0.

RT-PCR原理与实验技术

一、知识背景：

1、基因表达：DNA RNA Protein

单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白） 共合成109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。

在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：

A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。

＋

3、逆转录酶和RT-PCR

逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：

1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链

RT-PCR实验步骤 一．实验器具：

1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl 2.吸头：1ml、200μl、20μl 3.匀浆管：5ml

4.EP管：1.5ml、500μl、200μl

5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇) 6.量筒：100ml 7.容量瓶：1000ml

8.试管架：5ml、1.5ml、20μl 9.铝制饭盒：1-2个 10.大瓷缸：1个 11.锡泊纸：一卷 12.卷纸：2卷

13.三角烧瓶：带盖，稍大 二．实验器具处理

1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。高压后烤干备用。如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。

2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。 3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DEPC)。 三．试剂配制

1．DEPC水：吸

南医实验报告

生物化学实验报告

姓 名：

学 号：

专业年级： 级临床八年制

组 别： 第二实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

南医实验报告

【预习报告】 一、 实验原理

1)总RNA的提取与定量

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。

Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是

一、实验名称：RT-PCR实验

二、实验目的：对提取的完整RNA进行体外转录，并应用PCR手段进行大量扩增，说明某种基因在体内的表达情况。

三、背景知识：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。

四、基本原理：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA

一、实验名称：RT-PCR实验

二、实验目的：对提取的完整RNA进行体外转录，并应用PCR手段进行大量扩增，说明某种基因在体内的表达情况。

三、背景知识：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。

四、基本原理：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA

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生物化学实验报告

姓 名：

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专业年级： 级临床八年制

组 别： 第二实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

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【预习报告】 一、 实验原理

1)总RNA的提取与定量

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。

Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是

生物学实验技术

植物总RNA的提取及RT-PCR

一、实验目的

1. 学习从植物组织中提取总RNA的方法

2. 了解RT-PCR的基本原理和实验方法

二、实验原理

1. RNA提取的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

2. RT-PCR的原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。

三、仪器、药品与试剂配方

(一) 仪器及器皿

1． 低温离心机； 2．琼脂糖凝胶电泳系统； 3． 高压灭菌锅；

4. PCR仪； 5． 研钵； 6. 一次

生物学实验技术

植物总RNA的提取及RT-PCR

一、实验目的

1. 学习从植物组织中提取总RNA的方法

2. 了解RT-PCR的基本原理和实验方法

二、实验原理

1. RNA提取的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

2. RT-PCR的原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。

三、仪器、药品与试剂配方

(一) 仪器及器皿

1． 低温离心机； 2．琼脂糖凝胶电泳系统； 3． 高压灭菌锅；

4. PCR仪； 5． 研钵； 6. 一次