puc18质粒

wowenwenpUC18 和 pUC19质粒图谱

pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注册号为 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而来，其中 lacZ （MSC）来自 M13mp18/19 图 3-4 是其质粒图谱。

这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的 rop 基因，因此其拷贝数达 500-700 。 pUC 系列载体含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现 α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过 α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。

特征序列区位：

pBR322_origin Ampicillin lac_promoter

1471 - 852 2486 - 1626 543 - 514

AmpR_promoter 2556 - 2528

M13_pUC_rev_primer 500 - 478 M13_reverse_primer 479 -

质粒图谱列表(转贴) (2007-11-19 20:32:55)转载▼ 分类： 核酸技术

登记号--质粒--来源--用途--图谱提供者 0001--pIRES --BD Co--真核表达--yshu3507 0002--pECFP-C1--BD Co--真核表达--yshu3507 0003--pShuttle--/--/--victoh 0004--pSBR322--/--/--chujun_hust

0005--pcDNA3.1(+)/CAT--invitrogen--真核表达--wangjun2002274 0006--pQEx--Qiagen--原核表达--wangjun2002274 0007--pIVEX2.3--Roche--体外转录翻译--wangjun2002274 0008--pIRES-EGFP--/--/--luoqingli2003

0009--pET-28a（+）--Novagen--原核表达--wangjun2002274 0010--pSUPER Vector--oligoengine--siRNA--zyh961171 0011--pET-32a(+)--novagen--原核表达--Crazyvirus

基因序列分析：

同源比对（保守性） 不同蛋白比对相似序列 预测结构域 记录：

1） 保存预测结果（同源性、二级结构）

2） 记下mapping片段（mapping时以亲水端开头，考虑溶解性），相关性质（分子量、等

电点、碱性残基数（R250）、W+Y数目、摩尔吸光系数）

3） 确定载体（原核：His-tag/Trx-tag/MBP-tag；真核：GFP-tag/Cherry-tag/Flag-tag）

网站：

NCBI CDS（mRNA编码区) Expasy 软件： Jalview

1） sequence alignment：

a、用目的基因序列进行BLAST（NCBI），比较不同物种间（哺乳、两栖、低等……）该基因的保守性（xp,np来源较可靠）。（或直接基因名+物种名进行搜索）； Main:

human/Homo sapiens

chimpanzee/Pan troglodytes monkey/Macaca mulatta dog/

horse/Equus caballus cattle/Bos taurus pig/ Sus scrofa

mouse/Mus musculus Rat/Rattus norvegi

质粒与载体

点击次数：442 发表于：2008-07-08 17:32　转载请注明来自丁香园
来源：互联网


一、质粒

绝大多数的生物都是以DNA 的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication，或译为复制起点)，使整个基因体得以复制。含有复制原的遗传物质称为replicon，我们姑且把它译为为复制体吧！原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。其中质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼DNA 构成，并以超卷曲的形式存在。它们的基因体约由2,000至150,000个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如Borrelia burgdorfferi)。事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。在自然环境中它们相当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌(Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌(Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。以下我们谈的以细菌性质粒为主，

1. 菌液OD值越高，质粒产量越高

2. 大肠杆菌OD值越高，提取的质粒的浓度就越高吗？？？还要看质粒纯度，纯度一般

在1.8-1.9最适合，再高了就是蛋白污染

3. 一般而言gene 导入原核细胞称转化，导入真核细胞称转染。

4. 用QIANGEN质粒提取试剂盒提取质粒，我没有提不出来的经历，有以下几点要注意，

从细胞、试剂盒及操作三个方面考虑：

1..确定细菌是阳性转化子，应该含有你的质粒，过夜摇菌已足够，记得加抗生素。 2.关于试剂。溶液2中是否浑浊，SDS在低温产生结晶，使用前用37度水浴。溶液3中的醋酸钾可能产生结晶，使用前应该温水溶解。确认洗脱液1中的乙醇没有挥发，闻一闻就知道了。洗脱液2是否在使用前已加乙醇，加乙醇后在盖子上打钩，以免与没加的混淆。

3.抽提过程中，加溶液1（放4度保存）后应该充分悬浮菌体，以便裂解充分；加溶液2和3应该快，加溶液2后打开盖有丝状物，加溶液3出现絮状沉淀，离心要充分。请严格按说明书操作。

如果你觉得以上几点你都做的很好，试剂盒是新的，换含其它质粒的菌株试一试，如pUC18的转化子。如果试剂和是用过的，放置太久，换其它试剂盒吧，要不换土法试试！

5. Qiagen我卖这么多个，到目前还是零投诉。不过出现

实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化

一、实验目的

学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。

二、实验原理

在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。

三、实验材料

大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）

四、实验仪器、用具

高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪

五、实验试剂

LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖 抽提质粒DNA所需的溶液：

质粒DNA的提取、纯化与纯度鉴定

李笃财 生科

1班 201200140048

【实验目的】

1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理。 【实验原理】

1. 质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离

质粒DNA的提取、纯化和电泳检测

【实验目的】

1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用； 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法；

3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理； 4、学习并掌握凝胶的制备方法；

5、学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法；

6、验证E.coli DH5α与E.coli DH5α（pUC19）在含有氨苄培养基上的生长情况并了解其原理。 【实验原理】

1、携带外源基因并将外源基因导入宿主细胞，使之进行扩增和表达的媒介称为载体。在基因工程操作中载体具有以下性质：A.具有自主复制的起点；B.具有多个限制性核酸内切酶的单一识别位点（多克隆位点）；C.具有可供选择的遗传标记；D.具有高拷贝数。

2、质粒 DNA 是原核生物除类核中的染色体 DNA以外 ,细胞质中含有的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小环状双链 DNA 分子 。 除酵母的杀伤质粒为 RNA 外 , 迄今发现的所有质粒均为双链环状DNA 。 多数质粒只有几千个 bp 但也有一些质粒达105bp 以上 ,一般分子量在 ( 4～100) × 106道尔顿范围内 。不同的质粒在细胞内的拷贝数不同。细胞内含有1-3个拷贝的质粒为低拷贝质粒（严紧型复制），当质粒

详细分步的一步步教会怎么利用addgene网站查找质粒图谱

利用addgene查找质粒载体图谱

生物工程

杨翔

2012718026

摘要：

现如今的生物实验研究中，细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。在天然质粒的基础上，为了适应实验室操作而进行人工构建质粒载体。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点（MCS）序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。

做分子实验，经常和不同的质粒打交道，了解各种质粒的图谱信息是必需的，然而如何准确迅速的查找到所需要的质粒图谱，是实验研究的基础工作，这里简单介绍一下应用addgene网站查找质粒图谱的方法。

关键词：质粒图谱，addgene

一． Addgene简介

Addgenen是一个全球科学家质粒共享非盈利组织。它作为一个公益性组织，负责保存和提供质粒。 科学家发表文章如果涉及到质粒，会发一份到Addgene保存，其他科学家如果需要这个质粒，也可以向Addgene索取

二．网站首页界面

/点击此网址，进入addgene首页，可以看到如下界面。

菜单栏包括了：Home（首页），Deposit Pla

质粒转染大肠杆菌

材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），

氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒

仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），

无菌培养板，消毒1.5ml离心管，消毒枪头，无菌操作台

实验步骤：

1. LB培养基的配制：

在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min. 固态培养基

LB固体培养基及倒板 ：

（1）.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉

（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。

（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。 2. 从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使