过氧化氢酶米氏常数的测定实验报告

篇一：过氧化氢酶动力学常数测定

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）

1.7

2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）

(A?B)?VT?1.7FW?V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=

酶活(mgH2O2/g·min)=0.218

（A-B）=0.8 VT=20.25FW=5.032V1=2.5mlt=10min

二、动力学常数的测定 （一）原始数据

（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度

V0

（三）以1/V0对1/[S]0作图（用exc

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2

过氧化氢酶制备与测定

小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

摘要：

过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。

过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。 现报告如下：

一、实验器材

1、实验动物： 成年雄性小鼠 （河北医科大学实验动物中心提供）

2、主要器材： 托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电热恒温水箱，DY

实验一 过氧化氢含量的测定（高锰酸钾法）

一、 实验目的

（1） 掌握高锰酸钾法测定过氧化氢含量的原理、滴定条件和操作步骤；

（2） 掌握移液管及容量瓶的正确使用方法，熟悉液体样品的取样和稀释操作。

二、 实验原理

过氧化氢（H2O2）在工业、生物、医药等方面应用很广泛。利用H2O2的氧化性漂白毛、丝织物；医药上常用于消毒和杀菌剂；纯H2O2可作为火箭燃料的氧化剂：工业上利用H2O2的还原性除去氯气；植物体内的过氧化氢酶也能催化H2O2的分解反映，股在生物上利用H2O2分解所放出的氧气来测量过氧化氢酶的活性。由于H2O2有着广泛的应用，常需要测定它的含量。

由于在酸性溶液中，KMnO4的氧化性比H2O2的氧化性强，所以，测定H2O2的含量时，常采用在稀硫酸溶液中，室温条件下用高锰酸钾法测定。其反应为：

5H2O2+2MnO4-+6H+＝2Mn2++8H2O+5O2

开始反应缓慢，第1滴溶液滴入后不易褪色，待产生Mn2+后，由于Mn2+的催化作用，加快了反应速率，故滴定速度也应加快，直至溶液呈微红色且半分钟内不退色，即为终点。根据高锰酸钾浓度和滴定中消耗KMnO4的体积，按下式计算过氧化氢的含量：

．Ｖ（ＫＭｎＯ４）．Ｍ（Ｈ２Ｏ２）

实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 实验方案：

匀浆 制备过氧化氢酶 盐析 透析 层析 纯度及分子测定（SDS-PAGE） 过氧化氢酶测定 蛋白含量测定（lowry法） 米氏常数测定（Lineweaver-Burk）双倒数作图法 （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液

一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用 二、实验原理：

1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞

匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3、氯仿; Pr沉淀剂，CAT由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4、离心：离心机 离心力 分离固液 三、实验步骤：

1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g

2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,

组织捣碎机匀浆3-5min

3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min 4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液 5【、留样】取匀浆上清液60

实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 实验方案：

匀浆 制备过氧化氢酶 盐析 透析 层析 纯度及分子测定（SDS-PAGE） 过氧化氢酶测定 蛋白含量测定（lowry法） 米氏常数测定（Lineweaver-Burk）双倒数作图法 （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液

一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用 二、实验原理：

1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞

匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3、氯仿; Pr沉淀剂，CAT由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4、离心：离心机 离心力 分离固液 三、实验步骤：

1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g

2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,

组织捣碎机匀浆3-5min

3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min 4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液 5【、留样】取匀浆上清液60

实验一过氧化氢含量的测定(高锰酸钾法)

一、 实验目的

(1) 掌握高锰酸钾法测定过氧化氢含量的原理、滴定条件和操作步骤；

(2) 掌握移液管及容量瓶的正确使用方法，熟悉液体样品的取样和稀释操作。

二、 实验原理

(1)由于在酸性溶液中，KMnO 的氧化性比HO 的氧化性强，所以，测定 HO 的 含量时，常采用在稀硫酸溶液中，室温条件下用高锰酸钾法测定。其反应为：

5H2Q+2 Mn O+6H f = 2Mrn ++8H l Q+5O

实验室用NaQQ 标定KMnQ 容液，KMnQ 溶液在热得酸性溶液中进行，反应如下：

- + 2+ 2KMnQ +5HC 2C 4+6H=2 Mn +10CQ+8H2Q

C(K Mn Q=2m(Na￡2Q)/5M(K Mn Q)V(K MnQ)

开始反应缓慢，第1滴溶液滴入后不易褪色，待产生Mn +后，由于Mn +的催化 作用，加

快了反应速率，故滴定速度也应加快，直至溶液呈微红色且半分钟内不 退色，即为终点。根据高锰酸钾浓度和滴定中消耗 KMnQ 的体积，按下式计算过

氧化氢的含量：

式中p(H 2Q)――稀释后的HQ 2质量浓度，g/L 。

三、 仪器与试剂

仪器：移液管(25ml ),吸量管(10ml )，洗耳球，容量瓶(250ml

实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 实验方案：

匀浆 制备过氧化氢酶 盐析 透析 层析 纯度及分子测定（SDS-PAGE） 过氧化氢酶测定 蛋白含量测定（lowry法） 米氏常数测定（Lineweaver-Burk）双倒数作图法 （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液

一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用 二、实验原理：

1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞

匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3、氯仿; Pr沉淀剂，CAT由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4、离心：离心机 离心力 分离固液 三、实验步骤：

1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g

2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,

组织捣碎机匀浆3-5min

3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min 4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液 5【、留样】取匀浆上清液60