wb操作视频

Western Blotting试验步骤

一， 组织蛋白提取

1. 准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管中，充分混合。

注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。

2. 组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀将组织建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。

注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。

3. 将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至200ulEP管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。 二， 提取液中总蛋白的测定

用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。

1. 配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体

积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小

鉴于实验技术方法的改进以及试剂商品化程度的提高，本操作指南中的部分内容目前仅作参考学习，在实际实验过程中可能不会用到。 一、实验原理

在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。

二、蛋白样品制备（根据样品及检测要求选适当提取方法，蛋白样品制备是WB的第一步，更是决定WB成败的关键步骤。） 1. 样品与试剂 组织(Storage: -80℃)；

RIPA裂解液(强) (谷歌生物；beyotime:P0013B Storage: -20℃，一年有效。大瓶装买回来后及时用10ml EP管分装，尽量避免过多的反复冻融。在分装的Ep管上标明分装当日日期，每使用一支要在EP管上做个标记，用完一支再启封新的。如果不嫌麻烦，初次分装RIPA裂解液时分装于10ml Ep管中，用于组织裂解；用于上样蛋白配制的分装一部分于1.5ml Ep管中。

PMSF (谷歌生物；Solarbio: Cat.No.P0100 Lot.No.20150716 Storage: -20℃。100mM)

10×SDS样品缓冲液

量取下列试剂，置于10ml塑

WB的原理、操作及注意事项

原理：

通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织：

组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞：

细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例）：

直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。

WB的原理、操作及注意事项

原理：

通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织：

组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞：

细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例）：

直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。

Western blot 步骤： 配胶 制胶 跑胶

转移胶（转膜）

封闭和孵抗体 扫膜

一.配胶

这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

1.分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度） 2.浓缩胶

均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）

PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存

WB试剂配方

SDS-上样缓冲液(2X) 100ml （100 mM Tris-Cl (pH 6.8)；4% (w/v) SDS；0.2% (w/v) bromophenol blue；20% (v/v) glycerol；200mM DTT (dithiothreitol) Tris-base 1.2114g

SDS 4g bromophenol blue 0.2g glycerol 20ml

ddH2O 定容至80ml 1M DTT 20ml

Store the SDS gel-loading buffer without DTT at room temperature. Add DTT from a 1 M stock just before the buffer is used.

配胶：

30%丙烯酰胺（商品化29:1） Tris-HCl：

（1）分离胶（PH8.8）1.5M

称取Tris-base（MW121.14）91.855

WB步骤

WB仪器和试剂：

ELX800uv酶标仪（Bio-TEK公司） 电泳槽（Amersham Biscience公司） 转移槽（Amersham Biscience公司）

ECL发光试剂盒（Thermo公司） SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）（Beyotime） 硝酸纤维化膜（Pall Corporation） 抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司） SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（Beyotime） PBS（厂家：ORIGENE 批号：150309） 显影液(天津市汉中摄影材料厂) 定影液(天津市汉中摄影材料厂)

BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime） Western 一抗二抗去除液（Beyotime） 低温高速离心机（Eppendorf）

小鼠抗β-Actin单抗（MouseAnti—beta ActinMonoclonal Antibody） 辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（Perxidase—Conjugated Affinipure Goat Anti—RabbitIgG(H+L)）

PageRulerTMPrestained Protein Ladder（Thermo公司）

Anti—P Glycoprotei

第二章 视频编辑的基本操作

第一讲 切割视频片段

放大缩小时间线：鼠标中间的滚轮，向上滚可以把时间线变大，向下拉把时间线

变小。（时间线变大以后，我们可以精确某个时间点的进行精细的调节，变小便于我们从整体预览整段素材）

空格或enter 键预览的区别：按一下空格键或enter 键，视频都会开始播放，再按一下空格键或enter 键都会停止播放。区别在于按enter 键结束播放时，光标停在播放结束的位置；按空格键结束播放时，光标停在开始播放的位置。

左右箭头：光标逐帧移动，便于精确定位

减掉视频或图片中不要的部分：

快捷键s ，剪开，delete 删掉，把后边的素材向前拖。

一段视频放在另一段视频后面很近的时候，两段视频会自动吸附到一起，

就是在两段视频叠加的区域加上淡化的效果

视音频解锁和上锁：解锁-------选中素材，英文状态按U 键

上锁-------选中视频，按住shift 键，选中音频，英文状态按G 键

第二讲 改变画面大小及延长帧画面

改变画面大小

点开，弹出画面裁切器窗口，拖动四边形的边就可以裁剪，当几乎接近的时

候，可以调节左边的数字（position 属性，即位置属性）来进去调整。长方形里边的区域就是预览窗内显示的区域，而长方形以外，圆形以内的区域就裁剪掉

WB 实验步骤

1. 蛋白提取，吸出培养基，用适量DPBS清洗，吸出DPBS，尽量吸干净，加入适量细胞裂解液，冰上裂解15-30min

2. 用细胞刮刀刮取皿或瓶底部的细胞，收集至1.5ml的离心管中，12000rpm离心，4度，15-30min将上清转移到新的离心管中 3. 检测蛋白浓度，定量（20-40ug），用水和蛋白上样缓冲液配成30ul以内的体积，100度变性10min，冷却后离心，上样

4. 将胶装在电泳槽内，加入1x电泳缓冲液到指定刻度，拔出梳子用注射器清洗胶孔，上样 5. 60V电压压缩蛋白至同一位置（分离胶与浓缩胶交界处），130V分离蛋白。配置转膜缓冲液，并将膜浸泡其中，4度预冷

6. 待蓝色的缓冲液条带到达距离胶底面0.5cm处即可开始转膜，按照从负极到正极海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵的顺序组装，避免产生气泡，对应正负极放入转膜槽

7. 低温转膜90min，丽春红染色，初步判定WB效果，并在对应位置将目的条带剪下来 8. 用5%的脱脂牛奶封闭，室温1小时以上，用特定的一抗4度过夜 9. 清洗一抗，用适量的TBST，室温3次，每次10min

10. 加入对应的二抗，室温孵育1小时以上，并清洗3次，同9 11. 按1:1的

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。 原理

1． SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS聚丙烯