pcr结果常见问题及分析

对实时定量PCR实验中遇到的常见问题总结。

实时定量PCR中的常见问题及解决办法

1、反应后无扩增曲线出现

1）确认程序中是否设置了信号采集步骤：两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

2）扩增效率问题：电泳检测realtimePCR反应产物，观察是否有正确大小的目的条带出现。如果没有，则逐一排查引物、模板以及反应条件问题。

3）循环数不够：一般可设置循环数为40。

2、Ct值出现太晚

1）模板浓度过低或模板降解：重新制备模板再进行实验。

2）扩增效率低：优化反应条件，或者重新设计PCR引物。

3）PCR产物过长：一般设计为100-200bp即可。

4）反应体系中含有抑制剂：常在模板质量不高时出现，重新制备模板或将模板稀释后使用。

3、扩增曲线形状异常

1）扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。

2）扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。减小基线终点 (Ct值- 4)，重新分析数据。

3）个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

4、阴性对照出现扩增曲线

1）阴

ＰＣＲ－ＤＧＧＥ实验过程中

常见问题的分析与改进

刘丹，凌云

（上海海洋大学水产与生命学院，上海２０１３０６）

■■：对ｐｃＲ．ＤＩＧＧＥ实验过程中常见问题，如条带的有无、多少、拖尾、重影、扭曲、集中等问题进行了归纳总结，并提供了详细的解

决方法，如加强实验前仪器的检查；进行时间进程实验；选择适当的扩增引物、电泳温度和电流等。

关ｔ词：ＰＣＲ－ＤＧＧＥ；实验过程常见问题；分析；改进中圈分类号：Ｑ７８

文献标识码：Ａ

１陀Ｒ—ＤＧＧＥ技术概述

变性梯度凝胶电泳（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ

ＧｒａｄｉｅｎｔＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）技术是

由Ｆｉｓｃｈｅｒ和Ｌｅｎｎａｎ于１９７９年最先提出的一种用于检测ＤＮＡ突变的电泳技术，该技术可分辨出长度相同但序列不同的ＤＮＡ片段。Ｍｕｙｚｅｒ等在１９９３年首次将ＤＧＧＥ技术应用于微生物群落结构的研究。现在，这项技术广泛应用于各个领域的微生物分子生态学研究中。特别是细菌和真菌序列多态性的ＤＧＧＥ技术，已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。

２

ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术在实验过程中常见问晨的分析与改进

ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术在运用过程中，常出现图谱分辨率和结果分析偏差等问题，其中无条带或条带过少、重影或拖尾、扭曲、集中于某

二、基本问题

1、什么是高度角？如何计算高度角?

高度角是指直射阳光与水平面夹角。 计算公式为:

序号 1 2 3 4 5 计算公式 sinh。=cos(φ-δ) h。=90o-(φ-δ) h。=90o-(δ-φ) h。=90o-φ h。=90o+φ 注释 当A=0,t=0(正午12时太阳高度角) φ>δ δ>φ φ>δ春秋分正午 δ>φ春秋分正午 ( 式中h为高度角、δ为太阳赤纬、φ为当地纬度 )

2、什么是方位角？如何计算方位角?

方位角指的是直射阳光与水平投影和正南方位的夹角，正南为0o，午前为负值。 方位角的计算公式为：

序号 1 2 3 4 5 6 7 计算公式 注释 sinh=sinφsinδ+cosφcosδcost -90o≤h≤90o sinA=cosδsint/cosh -180o≤A≤180o或0o≤A≤360o cosA=(sinhsinφ-sinδ)coshcosφ -180o≤t≤180o或0o≤t≤360o sinA。=cosδcost cos A。=-sinδ/cosφ cost。=-tgφtgδ t=15o(n-12) H=0(日出日没时方位角) H=0 负值为日出时角，正值为日没时角

常见问题 边坡

1． 在边坡稳定分析中，土体中的孔隙水压力有几种计算方法，他们的区别是什么？

答：两种，分别为近似方法计算、渗流方法计算。区别是：

前者认为孔隙水压力等于静水压力，是一种近似方法；

后者是精确计算孔隙水压力。需要通过读入渗流软件计算结果才能实现。

2． 边坡软件中，如何考虑锚杆作用？

答：软件要求输入锚杆抗拉力、锚杆总长、锚固段长度、锚固段周长、粘结强度等参 数，当锚杆穿过圆弧滑动面时，则锚杆的有效作用力=min{锚杆抗拔力、锚杆抗拉力} 锚杆抗拔力=圆弧滑动面外锚杆锚固段长度*锚固段周长*粘结强度 锚杆抗拉力=锚杆抗拉力

3． 锚杆的抗拉力交互的是标准值还是设计值？粘结强度是标准值还是设计值？

答：标准值和设计值的概念是在锚杆设计时用的，由于软件不设计锚杆，而是应用锚杆提供的锚杆力的

分力作用在滑面上，使得抗滑力增加或下滑力减少，来计算边坡的稳定。

锚杆力=Min﹛抗拉力，锚固体周长*锚固长度*粘结强度﹜。在软件中，交互的数值在软件中被直接使用，软件不做任何修正。

4． 土工布或锚杆的抗拉力和水平间距的关系是什么？

答：软件是先用交互的抗拉力除以水平间距，得出单位宽度的抗拉力，以单位宽度的抗拉力带入计算。 如果土工布时满铺的，

二、基本问题

1、什么是高度角？如何计算高度角?

高度角是指直射阳光与水平面夹角。 计算公式为:

序号 1 2 3 4 5 计算公式 sinh。=cos(φ-δ) h。=90o-(φ-δ) h。=90o-(δ-φ) h。=90o-φ h。=90o+φ 注释 当A=0,t=0(正午12时太阳高度角) φ>δ δ>φ φ>δ春秋分正午 δ>φ春秋分正午 ( 式中h为高度角、δ为太阳赤纬、φ为当地纬度 )

关于有效太阳高度角：是由地方相关部门设定的，青岛为15°（＜15°的阳光太弱，可以忽略不计），众智日照分析软件中可以在参数-系统设置里把最小入射角改为15°，而界面的有效太阳高度角不点开。

2、什么是方位角？如何计算方位角?

方位角指的是直射阳光与水平投影和正南方位的夹角，正南为0o，午前为负值。 方位角的计算公式为：

序号 1 2 3 4 5 6 7 计算公式 注释 sinh=sinφsinδ+cosφcosδcost -90o≤h≤90o sinA=cosδsint/cosh -180o≤A≤180o或0o≤A≤360o cosA=(sinhsinφ-sinδ)coshcosφ -180o≤t≤180o或0o≤t≤36

关心问题

与我司进行合作的客户都会出现很多怀疑的问题，甚至对不明就里的这个行业持有负面性的发难，直到用配资的实盘账户操作了一段时间后才认识清楚配资究竟是何物何事。

除去配资流程的了解和签订合约外，我所了解到的问题大概如下，也是大多在股市、期市有较好盈利能力却受制于自有资金量小的客户群体对配资行业将信将疑的总体态势。

一，配资行业是否合法的问题。 于此，本人咨询了一位律师朋友后，从较专业的角度阐明这个行业属于处在没有明文法规界定的地位，既没有令行禁止，也没有提倡力行，所以客观说来是不违法违规的边缘化行业。从社会存在的必要性看来，存在即是具备一定的合理性。而从社会心理学角度看来，需求决定供给，而非供给产生需求，这表明了配资的需求其实是有隐性特质的，不过是在配资公司的行销方式给被动刺激后才逐渐显性化的。简而言之，在法律实践和实施体例上，配资行业是“中规合法”的。

二，配资公司是否合法的问题。

纵观国内经营配资业务的公司情况，法人名称都没有出现“配资”的关键字，这表明工商审核程序中还没有允许出现对配资业的认可态度，而是准许经营业务里面可以有股票、股指期货的配资融资业务。这对主营配资业务的公司造成“名不正，言不顺”的劣势。大都是将经营业务附属在投资担保

TE单验及常见问题分析

Security Level:

LTE站点单验及常见问题分析2014-9-11

HUAWEI TECHNOLOGIES CO., LTD.

TE单验及常见问题分析

目录单验流程

Probe软件介绍 Assistant软件介绍 问题分析流程及优化案例

小结

HUAWEI TECHNOLOGIES CO., LTD.

Huawei Confidential

TE单验及常见问题分析

单验流程 核查站点运行状态、告警信息、站点信息 测试工具准备 计费数据

测试前准备

测试过程

数据核查采集过程 功能验证过程

问题处理问题处理

测试报告输 出

测试报告输出

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TE单验及常见问题分析

单验流程单验前一天 单验前一天要先对单验站点进行告警查询和小区状态查询 核查小区参数配置是否正确 单验前要采集站名、站址、等各项信息。

单验过程 出发前要先检查设备是否正常 出发时可以通过借助Probe软件连接GPS导路，找到单验站点的位置。 找到站点后我们需要采集站点的站高、经纬度、方位角、下倾角、天线顺序等各项参数。

采集完这些参数后我们就可以对站

引物合成常见问题分析 1．需要合成多少OD的oligo？

一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及 2000—2500 次的测序反应。因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。

如何测定引物的OD值：

DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。

例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

2. 如何检测Oligo DNA的纯度？

实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可

一、贪玩，自制力差：谁都有自制力差的时候，这不是您孩子一个人的问题，有可能有以下几种原因造成的：

首先，原因应该从小的时候来看，可能以前没有注意对孩子注意力的培养，造成孩子的注意力分散；

其次是生活环境的多样性，造成孩子对环境的适应性弱，久而久之就产生了贪玩的特点，应该说，孩子贪玩是自制力差的根本原因。

第三是没有目标，由于现在生活条件好，孩子不需要操心，什么也不用他来操心，而且家长也不让孩子多操心，他的动手能力和动脑能力都没有得到开发，而他心理上又有能量，需要活动，这样他就寻找自己心理能量的发泄方式，就形成了贪玩的特点

我们提供解决的办法是：

第一，让学生自己有机会沉下心来学习，开始时家长要进行督促，但不要进行强制性安排，而是通过提醒的办法，让他自己去做，过一段时间，他自己能做好了，再放手让学生自己做。

第二，让孩子多动手，家里有些力所能及的活要让他亲手干，多动手是培养自制力的好方法。

第三是要帮他树立目标，男孩子往往都有自己崇拜的英雄，要帮他分析成为英雄的条件是什么，所谓学有榜样，干有劲头，包括他所喜欢的动画英雄，都可以帮他分析，让他有学习的榜样。

第四，要多注意他都玩些什么，有时可以和他一起玩，特别是做父亲的，更要多和孩子沟通，和孩子

小学儿童常见问题分析<1>——孩子为什么不注意听讲

因为每周二上午接听齐鲁晚报的成长热线，每周四接听山东商报的家长热线，我听到了太多的家长向我反映，孩子不注意听讲，孩子不愿意写作业，孩子粗心马虎，孩子磨磨蹭蹭，孩子撒谎拿钱，孩子有攻击行为，动不动就打人；孩子有退缩行为，在学校里老是受欺负，等等等等，家长为此困惑不已。孩子的这些问题到底是怎样形成的？应该怎样帮助孩子克服这些问题？今天，由于时间的关系，我不可能把这些问题都讲透了。如果家长认为有必要，可以反映给活动中心，再安排一次课/我今天只重点讲两个方面的问题，一个是孩子不注意听讲的问题，一个是孩子粗心马虎的问题。

一、不注意听讲

几乎每个孩子都有不注意听讲、走神的时候。我们这里不讨论一般的不注意听讲问题，我们讨论的是严重的不注意听讲，即经常的、持续的、弥漫性的、公然的、屡教不改的、令老师无法忍受的那一类的不注意听讲。

许多老师遇到严重不注意听讲的情况，都简单地认为是孩子对学习不重视，或者不想学习。老师的对策，就是给孩子大讲学习的重要性，课上提醒、批评、罚站，赶出教室，再解决不了，

1

就请家长。家长呢，听到老师的反映，不是设法了解孩子不注意听讲的原因，而是反复地叮咛孩子，要认真听讲，要认真听讲，可是