mirRNA引物设计

miRNA常用实验方法；一、miRNA的检测方法；miRNA的realtime-PCR检测方法；1、realtime-PCR引物设计；miRNArealtime-PCR引物设计方法：；1）stem-loopRT引物设计：基于通用的茎；GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG；2）realtime上游引物设计：miRNA序列；3）下游引物是通用的，序列miRNA常用实验方法

一、 miRNA的检测方法 miRNA的realtime-PCR检测方法 1、 realtime-PCR引物设计

miRNA realtime-PCR引物设计方法：

1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端

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个碱基即可。通用茎环结构序列为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT 2）realtime 上游引物设计

PCR引物设计要点

1. 书写规则

设计引物时，5’端引物与目的序列正义链相同，而3’端引物则与目的序列正义链互补，书写时从引物的5’端至3’端（即5’端引物不变，3’端引物与目的序列互补并相反）； 2. 引物长度

一般引物长度为18~30碱基（不包括5’端添加的修饰），引物太长和太短都不好； 3. GC含量

一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，不要有聚嘧啶或聚嘌呤，尤其3’端不应超过3个连续的G或C。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴，上下游引物的GC含量不能相差太大； 4. 退火温度

可以用软件PrimePrimer来计算退火温度，在引物短于20bp时，可以用公式Tm=4(G+C)+2(A+T)-5估计Tm值(解链温度)，有效引物的Tm为55~65℃之间较好，如果待扩增基因的GC含量较高（超过50%），引物的退火温度可设计得高一点，例如接近65℃，因为提高退火温度可以降低非特异性扩增。一对引物的退火温度应尽量接近，相差范围应在5℃之内；

一般初次PCR使用的退火温度比计算出的解链温度低5℃，如果扩不出，可试着将退火温度降低5℃ 和升高5℃再试一下，但一般不要1℃ 1℃升，或1℃ 1℃

PCR引物设计过程

（一）设计引物前应的准备工作：

1．准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 2．对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用 3．准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用

（二）引物的结构：5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’ 1．两个酶切位点 2．酶切位点的保护碱基 3．5’端保护碱基 4．3’端保护碱基 5．引物配对区

（三）设计引物所要考虑的问题 1．酶切位点

两个酶切位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，否则往往导致两个酶都切不好。因此，两个酶切位点要紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好隔四个核苷酸。且不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。 2．酶的选择

最好使用双酶切效率高的，但两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切，最好使用具有共同buffer，且较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），这样可以省钱。 3．Tm的计算。

Tm是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区

PCR引物设计过程

（一）设计引物前应的准备工作：

1．准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 2．对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用 3．准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用

（二）引物的结构：5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’ 1．两个酶切位点 2．酶切位点的保护碱基 3．5’端保护碱基 4．3’端保护碱基 5．引物配对区

（三）设计引物所要考虑的问题 1．酶切位点

两个酶切位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，否则往往导致两个酶都切不好。因此，两个酶切位点要紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好隔四个核苷酸。且不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。 2．酶的选择

最好使用双酶切效率高的，但两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切，最好使用具有共同buffer，且较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），这样可以省钱。 3．Tm的计算。

Tm是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区

PCR引物设计流程

（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）

一． 流程图

二． 确定模板 1. 确定模板来源物种

近亲物种 ：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等

常用物种 ：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）

一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。 2. 利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列

A. 进入NCBI主页 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。

B. 点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。如下图。另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考 http://www.ncbi.nlm.nih.gov

PCR引物设计流程

（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）

一． 流程图

二． 确定模板 1. 确定模板来源物种

近亲物种 ：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等

常用物种 ：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）

一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。 2. 利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列

A. 进入NCBI主页 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。

B. 点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。如下图。另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考 http://www.ncbi.nlm.nih.gov

shRNA原理

shRNA 克隆原理及引物设计

一．DNAoligo设计

1.来源：1）文献报道（优先考虑）

2）网站

利用网站提供的软件设计DNAoligo：

主要使用网站有3个, 老师认为不同算法得到重合的序列比较可靠, 故三者应综合使用 网站:

举例：HEXIM1shRNA设计

A: siDirect

输入accession number, 点”retrieve sequence”, 得到完整序列. 或直接输入序列

shRNA原理

设置只要将"contiguous sequences to avoid-A's or T's" 选上, 如图下

点design siRNA

结果: 页面一次只显示100个碱基(如1-100), 需要点击所需段来查看

优先选择“Effective, Both strand”, 但“Effective, Plus strand”也可用 显示的序列23个碱基, 应去头尾各2个, 取中间19位碱基

shRNA原理

B: Dharmacon

输入accession number, step 4中选blast, database选human 点”design siRNAs”

shRNA原理

结果: 优先选择score高, mismatc

PCR 之引物设计--------基因序列查询篇 ?确定目标基因的形态：DNA or RNA ?查找目标基因

?比对目标基因同源性和特点 ?选取目标基因序列

?选取目标基因的目标区段

第一步：如何查基因：

1、mRNA 序列的查询； 以查大鼠cort为例；

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

search 选择 nucleotide for 1、rat cort 1、 在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA， Copy该ｍＲＮＡ序列作为软件查询序列的候选对

象。

该mRNA文件的命名： Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA； NM_012835：是唯一的编号；

把以下序列存成ｔｘｔ文件：

Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA

* Comment * Features * Sequence

LOCUS NM_012835 438 bp mRNA linear ROD 11-FEB-2008 DEFINITION

PCR 之引物设计--------基因序列查询篇 ?确定目标基因的形态：DNA or RNA ?查找目标基因

?比对目标基因同源性和特点 ?选取目标基因序列

?选取目标基因的目标区段

第一步：如何查基因：

1、mRNA 序列的查询； 以查大鼠cort为例；

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

search 选择 nucleotide for 1、rat cort 1、 在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA， Copy该ｍＲＮＡ序列作为软件查询序列的候选对

象。

该mRNA文件的命名： Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA； NM_012835：是唯一的编号；

把以下序列存成ｔｘｔ文件：

Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA

* Comment * Features * Sequence

LOCUS NM_012835 438 bp mRNA linear ROD 11-FEB-2008 DEFINITION

LAMP原理及引物设计与实例 ．LAMP引物的设计

LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。

FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。

F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。

BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.

B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。

2．扩增原理

60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。