地高辛标记的原位杂交

原 位 杂 交

(In situ hybridization)

一、 目的

掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。

二、 原理

原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。

原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

三、 仪器设备

烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、

吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。

四、 材料和试剂

1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。 2．试剂：

Da

原位杂交

1 探针的设计与合成

1) 根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82， 以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。引物编号 p81 p82

2) 目的片段克隆

a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下：目的PCR片段5 μl

pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl 10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积 10 μl

b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。

c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal（20mg/ml），使用无菌的弯头

原位杂交流程 卢朝晖 整理

以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针，对石蜡切片进行mRNA检测的流程图。这些实验操作方法很多参考书中均有，但没有一本书是专为这个目的而系统地加以总结的，因此特加以综合供同行参考，在具体操作过程中很多地方可酌情变更。 在临床应用中，常常可以买到已经标记好的商品探针，那么前面一大部分扩增基因、酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去，从石蜡切片处理做起即可。 下面介绍的方法笔者已亲手做过数次，可获满意结果。 主要操作步骤： 制备感受态细菌

用含目的基因的质粒转化细菌 小量培养转化的细菌 小量提取质粒 小量酶切质粒 电泳鉴定

大量培养转化的细菌 大量提取质粒 大量酶切质粒

电泳分离、回收及纯化 标记探针

石蜡切片的处理 预杂交、杂交 杂交后处理

抗体连接、显色

制备感受态细菌

【试剂及配制】 1．LB液体培养基

在900ml三蒸水中加入： 胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(b

附件3

人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册技术审查指导原则

本指导原则旨在指导注册申请人对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。

本指导原则是对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、范围

人表皮生长因子受体2（Human Epidermal growth factor Receptor 2，HER2）基因定位于染色体17q12，是表皮生长因子

— 1 ——

受体（EGFR）的成员

附件3

人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册技术审查指导原则

本指导原则旨在指导注册申请人对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。

本指导原则是对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、范围

人表皮生长因子受体2（Human Epidermal growth factor Receptor 2，HER2）基因定位于染色体17q12，是表皮生长因子

— 1 ——

受体（EGFR）的成员

附件3

人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册技术审查指导原则

本指导原则旨在指导注册申请人对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。

本指导原则是对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、范围

人表皮生长因子受体2（Human Epidermal growth factor Receptor 2，HER2）基因定位于染色体17q12，是表皮生长因子

— 1 ——

受体（EGFR）的成员

胚胎原位杂交技术

1通过分析mRNA在不同发育时期组织中的表达变化，有助于了解胚胎发育的基因调控机制。原位杂交是研究胚胎基因表达的常用方法，在发育生物学研究中起重要作用。胚胎原位杂交包括全胚胎原位杂交和胚胎组织切片原位杂交。

全胚胎原位杂交技术(whole mount in situ hybridization)可以从整体水平反映胚胎发育过程中基因表达的时空顺序，是一种广泛应用于胚胎发育调控基因表达研究的技术。该技术实验步骤少，简单易行，大量减少了分析所需时间。

全胚胎原位杂交成功的关键因素是进行适当的蛋白酶

K处理。使用不同探针时，应摸索

不同的蛋白酶K浓度、处理时间和温度。

全胚胎原位杂交实验中。经常会出现背景信号太强或信噪比太低的情况。产生这些情况的原因，通常是由于探针或抗体滞留于胚胎体腔和体室以及杂交后漂洗的条件不够严格等。杂交预处理前，将胚胎在解剖镜下用细针在脑室、颈背部、颌面部和心室等处刺孔，以使反应后的探针或抗体不在这些部位滞留。并在漂洗时充分洗除。同时。杂交后使用RNA酶充分消化未杂交的标记RNA探针，提高杂交后漂洗的严格度，抗体反应后充分漂洗均能降低背景信号，提高信噪比。

对较大的胚胎标本

胚胎原位杂交技术

1通过分析mRNA在不同发育时期组织中的表达变化，有助于了解胚胎发育的基因调控机制。原位杂交是研究胚胎基因表达的常用方法，在发育生物学研究中起重要作用。胚胎原位杂交包括全胚胎原位杂交和胚胎组织切片原位杂交。

全胚胎原位杂交技术(whole mount in situ hybridization)可以从整体水平反映胚胎发育过程中基因表达的时空顺序，是一种广泛应用于胚胎发育调控基因表达研究的技术。该技术实验步骤少，简单易行，大量减少了分析所需时间。

全胚胎原位杂交成功的关键因素是进行适当的蛋白酶

K处理。使用不同探针时，应摸索

不同的蛋白酶K浓度、处理时间和温度。

全胚胎原位杂交实验中。经常会出现背景信号太强或信噪比太低的情况。产生这些情况的原因，通常是由于探针或抗体滞留于胚胎体腔和体室以及杂交后漂洗的条件不够严格等。杂交预处理前，将胚胎在解剖镜下用细针在脑室、颈背部、颌面部和心室等处刺孔，以使反应后的探针或抗体不在这些部位滞留。并在漂洗时充分洗除。同时。杂交后使用RNA酶充分消化未杂交的标记RNA探针，提高杂交后漂洗的严格度，抗体反应后充分漂洗均能降低背景信号，提高信噪比。

对较大的胚胎标本

仪器设备

1、 医用微波炉； 2、 水浴锅；

3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜；

4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。

FISH试剂

（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃； （2）20×SSC（pH7.0）；

（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成； （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。

（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。

（6）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。

实验步骤

1、脱蜡：

1）二甲苯脱蜡3次，每次5min； 2）100％酒精两次，每次2min；

3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。 2、蛋白酶处理:

1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2） 37℃水

Protocol

RNA FISH on Cultured Cells in Interphase

1. Ng Karen1 and 2. Anton Wutz + Author Affiliations 1. Research Institute of Molecular Pathology (IMP), 1030 Vienna, Austria 1. ?1Corresponding author (ng@imp.univie.ac.at)

Next Section

INTRODUCTION

Fluorescence in situ hybridization (FISH) has become a widely used method in genome and molecular genetic studies. The technique is highly versatile and has been adapted to carry out genome-wide screenings, microarray quantifications, cancer cytogenetics analysis, and RNA ex