琼脂糖凝胶电泳实验报告思考题

实验一：琼脂糖凝胶电泳对DNA提取

实验目的：学习使用水平式琼脂糖凝胶电泳进行DNA的提取。

实验原理：琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用生物染料嵌入DNA分子后在紫外下显色。

1）在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。由于糖——磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

2）在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量和不同构型的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

3）生物染料在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，生物染料从正极向负极移动，就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在生物染料足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。

实验材料：微量移液器(2μl和4μl)，高压灭菌锅，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置，微波炉等。TAE电泳缓冲液，琼脂糖凝胶，PCR 扩增样品

琼脂糖凝胶电泳

1.原理

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向

琼脂糖凝胶电泳

1.原理

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向

一、琼脂糖凝胶的特点

天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80％）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。 1. 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。

2. 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

3. 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。

4. 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。

目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。

琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方

DNA琼脂糖凝胶电泳

一、 基本原理

当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。

由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。该公式指球形颗粒所受的阻力。代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。 带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：

m＝μ/E=d*l/V*t

d为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。

在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化

一、琼脂糖凝胶的特点

天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80％）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。 1. 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。

2. 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

3. 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。

4. 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。

目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。

琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方

DNA琼脂糖凝胶电泳

一、 基本原理

当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。

由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。该公式指球形颗粒所受的阻力。代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。 带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：

m＝μ/E=d*l/V*t

d为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。

在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化

生物技术

实验三 琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化

一、实验目的

1、掌握琼脂糖凝胶制备方法

2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA方法

3、掌握PCR产物回收和纯化方法

二、实验原理

根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。

电泳过程中或电泳完毕，直接利用低浓度的荧光染料EB（溴化乙锭）进行染色，EB可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出荧光，既可以确定DNA条带在凝胶中的位置，而且灵敏度很高，少至1～10 ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。

不同浓度琼脂糖凝胶分离的范围

琼盒回收纯化PCR产物。试剂盒中有一个特制的Column，将硅胶填充到这个特制的管中，利用硅胶在高盐低pH下，吸附DNA，在低盐和高pH条件下DNA可再被洗脱的原理， 进行DNA的回收和纯化。

此外还有玻璃奶（Glassmilk法），冻融法等方法 回收纯化DNA。

三、主要实验仪器和试剂

主要仪器：

电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。

实验一、质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

掌握质粒DNA提取的基本原理与实验技能，同时熟悉DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理与实验技能，进而了解质粒和核酸的基本性质以及琼脂糖凝胶电泳的特性。同时，掌握微量移液器、凝胶成像系统、紫外投射仪等实验仪器的使用方法。

二、实验原理

利用SDS使细胞膜裂解，同时在碱作用下细菌的线形染色体DNA变性，而质粒DNA（共价闭合环状DNA，cccDNA）的二条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，从而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中，通过离心将可以将质粒DNA提取出来。DNA制备膜可选择性地吸附DNA，从而可快速地纯化质粒DNA。

琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。实验室中常规实验，一般用琼脂糖水平凝胶电泳装置进行DNA电泳。DNA在琼脂糖凝胶电泳中的快慢与DNA分子大小、琼脂糖浓度、DNA分子构象、电流电压和离子强度等多种因素有关。

DNA的显色原理为溴化乙啶（EB）或其它染料可嵌入堆积的碱基对之间，

实验一、质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

掌握质粒DNA提取的基本原理与实验技能，同时熟悉DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理与实验技能，进而了解质粒和核酸的基本性质以及琼脂糖凝胶电泳的特性。同时，掌握微量移液器、凝胶成像系统、紫外投射仪等实验仪器的使用方法。

二、实验原理

利用SDS使细胞膜裂解，同时在碱作用下细菌的线形染色体DNA变性，而质粒DNA（共价闭合环状DNA，cccDNA）的二条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，从而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中，通过离心将可以将质粒DNA提取出来。DNA制备膜可选择性地吸附DNA，从而可快速地纯化质粒DNA。

琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。实验室中常规实验，一般用琼脂糖水平凝胶电泳装置进行DNA电泳。DNA在琼脂糖凝胶电泳中的快慢与DNA分子大小、琼脂糖浓度、DNA分子构象、电流电压和离子强度等多种因素有关。

DNA的显色原理为溴化乙啶（EB）或其它染料可嵌入堆积的碱基对之间，