质粒dna的提取及酶切检测实验报告

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

1.PCR(多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DN

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

1.PCR(多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DN

1 分子实验报告 2013030020华天瑞

Preparation of Plasmid DNA, Restriction Enzyme Digestion, and

Agarose Gel Electrophoresis

2014/10/14-21

1 Intro

1.1 Objective

To learn

? The characteristics of plasmid DNA

? The method of plasmid DNA mini-preparation by alkaline lysis and the measurement of

DNA concentration by spectrophotometer ? The characteristics of restriction endonuclease

? How to use agarose gel electrophoresis to separate DNAs To understand: The principles of pu

1 分子实验报告 2013030020华天瑞

Preparation of Plasmid DNA, Restriction Enzyme Digestion, and

Agarose Gel Electrophoresis

2014/10/14-21

1 Intro

1.1 Objective

To learn

? The characteristics of plasmid DNA

? The method of plasmid DNA mini-preparation by alkaline lysis and the measurement of

DNA concentration by spectrophotometer ? The characteristics of restriction endonuclease

? How to use agarose gel electrophoresis to separate DNAs To understand: The principles of pu

遗传分子生物学实验

质粒DNA DNA的限制性内切酶酶切 实验二 质粒DNA的限制性内切酶酶切

遗传分子生物学实验

一 实验目的了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 DNA

限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的 DNA DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 水解酶 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。 重组中重要的工具

遗传分子生物学实验

第一类( 第一类(I型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没 附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链， DNA分子中的双链 有专一性，是随机的。这类限制性内切

质粒DNA的提取、定量、 酶切与PCR鉴定

一、实验流程简述实验内容流程 ↓ 质粒DNA提取(约1小时) ↓ 紫外检测定量知识(计算方法),步骤 ↓ 紫外检测定量 ↓ 酶切步骤 ↓ 酶切约1~2小时 ↓ 学习酶切原理，琼脂糖电泳原理 ↓ 电泳(样品：质粒DNA,酶切产物，Marker) ↓约30分钟 观察电泳结果、记录、拍照、保存

二、实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原 理和测定方法 了解质粒酶切鉴定原理 学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的 构型、分子量的大小

质粒DNA的提取与定量Extraction and Quantitation of Plasmid DNA

一、什么是质粒？ 独立于细菌染色体 以外，能独立自主 复制的闭合环状 DNA分子；

基因工程常采用的 载体

方法：碱裂解法； 煮沸裂解； 羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法； 酸酚法 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行 处理及用加热处理 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离、纯化质粒DNA

二、实验原理基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的 差

动物肝脏中DNA的提取及检测

一、前言

脱氧核糖核酸

脱氧核糖核酸（DNA，为英文Deoxyribonucleic acid的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。

DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。

在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，

质粒DNA的提取、纯化与纯度鉴定

李笃财 生科

1班 201200140048

【实验目的】

1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理。 【实验原理】

1. 质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离

实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化

一、实验目的

学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。

二、实验原理

在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。

三、实验材料

大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）

四、实验仪器、用具

高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪

五、实验试剂

LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖 抽提质粒DNA所需的溶液：

质粒DNA的提取、纯化及验证

一、实验目的

1、掌握碱变性提取法质粒DNA的原理、方法及各种试剂的使用 2、掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理和方法。 二、实验材料、试剂及器具 1、材料

E.coliDH 5α（pUC 19 vector） 2、试剂

1)LB培养基 2)TE缓冲液 3)裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ 4)无水乙醇 5)70%乙醇 6）苯酚、氯仿 7)氨苄青霉素 3、器具

离心机、离心管、枪尖、移液枪 三、实验步骤 1、质粒提取

取LB平板上E.coliDH 5α（pUC 19 vector）→接种到LB+AP(20ml)培养基37℃,过夜培养→第二天早晨转接到LB+AP(50ml)培养基中，37℃，4-6h→称离心管空管重量W1，取约40ml菌液（装到离管上缘1cm处）→7000rpm离心5min→弃上清，加5ml溶液Ⅰ,涡旋打散菌泥洗涤再离心（7000rpm,5min）→弃上清，干燥，称重W2→每100ml菌泥加入溶液Ⅰ1ml,涡旋，冰浴5min→按量加入溶液Ⅱ2ml,轻加轻摇，冰浴5min→按量加入溶液Ⅲ1.5ml,轻加轻摇，冰浴10min→12000rpm,15min→转上清液至新管，加1/10V 3mol/