重组质粒的连接转化及筛选

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

实验目的：

1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核

酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA

分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。

5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大

小。

7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：

外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

摘要

本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。所用的酶有Hind Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。由于Hind Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。

关键字 酶切 连接 转化 重组子琼脂糖凝胶电泳

引言

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。本实验的供体是λ DNA，受体是E.coliDH5α,载体是PUC19。

DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类

重组质粒的转化

重组质粒的转化(热休克法)

本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2μl质粒即可）。 本流程以α-互补鉴定为例。适用于含有?-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。

㈠试剂及材料:

1. IPTG溶液(异丙基硫代-?-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。 2. X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。 3. LB液体培养基（无抗生素）。

4. 含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4μl 200mg/ml IPTG和16μl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。

基因工程的重组连接 ——DNA连接酶

DNA连接酶

概念：DNA连接酶存在于各种生物体内，其催化的基本 反应形式是将DNA双链上相邻的3 ’羟基和5’磷酸基团共 价形成3 ’ -5’磷酸二酯键，使断开的DNA切口连接起来， 因此它在DNA复制、修复以及体内体外的重组过程中起 重要作用。 分类： 1. E.coli DNA ligase:需要烟酰胺腺嘌呤（NAD+）作辅助因 子， NAD+ +酶 酶-AMP，同时释放出烟酰胺单核 苷酸（MMN） 活化的酶复合物在DNA切口处修复磷 酸二酯键，并释放AMP。 2. T4 DNA ligase：由T4噬菌体基因编码，分子量约为 60KDa。其活性以ATP为辅助因子，它与酶形成复合物， 并释放磷酸焦磷酸基团。

DNA连接酶

目前基因工程所使用的DNA连接酶多是来源于T4噬菌体 的T4DNA连接酶，因为它与大肠杆菌DNA连接酶相比， 具有以下特点： 修复双链DNA上的单链缺口（二者均相同），这是两种 DNA连接酶的基本特征； 连接DNA-RNA杂交双链上的DNA或RNA缺口，其中后 者反应速度较慢； 连接完全断开的2个平头双链DNA分子，反应速度通常 是粘头连接的1/10-1/100，因此这种反应属于分子间连

重组质粒的酶切和PCR验证

姓名：郑小煜

学号：201100140069 班级：11级生物技术班 同组者：赵莉、高瑞

【实验目的】

1、 检验重组质粒的插入片段的大小

2、 学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术。

【实验原理】

（一） 重组质粒酶切鉴定

将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。 （二） 引物设计

1、引物

体内，引物是一段与模板DNA互补的RNA单链

体外PCR反应中，引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，分别与靶DNA模板的两端互补，从而界定了产物的范围

引物能否与靶DNA特异结合，决定了PCR的特异性；引物能否被DNA聚合酶有效延伸，决定了PCR的灵敏性。

2、引物设计原则

长度：15-30nt，longPCR或某些特殊的PCR需使用较长的引物。 碱基分布：随机分布，同一碱基不应连续出现超过4次。 GC含量：一般40-60%。太低会导致引物Tm值较低，不利于PCR的特异性；太高则不利于引物结合，亦能引发非特异扩增。→Tm值(55℃-65℃)过低，PCR特异性低；过高，PCR效率低，

大肠杆菌的培养

1. LB培养基配制： （液体培养基） ① 取1L的烧杯，加入适量的一蒸水（＜1000ml），称取胰蛋白胨 10g , 酵母提取物 5g , Nacl 10 g 倒入烧杯中

② 加入磁子搅拌，至完全溶解 ③ 用NaoH调PH=7.0，定容至1L ④ 分装后高压蒸汽灭菌 （固体培养基） ① 在液体培养基的基础上加入琼脂糖：1L液体培养基→15g琼脂糖（用水先溶解） ② 在电炉子上边加热边搅拌至煮沸溶解 ③ 分装后高压灭菌

抗生素的加入温度要求：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 注意事项：

① 电炉子温度不要太高，烧杯直接加热时电炉子上要加石棉网 高压灭菌时，瓶盖上要插上针头，防止灭菌时瓶盖喷出 2. 倒平板：

培养皿要提前进行灭菌、烘干，在超净工作台里，打开酒精灯，在酒精灯的火焰旁进行操作，倒完后做好标记

3. 接种（平板划线分离法）：

接种环挑取大肠杆菌进行接种：图式：

注意：每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。 4. 37°恒温培养箱培养：

接种好的培养皿正置15分钟，然后倒置放入培养箱过夜培养

倒置培养原因：恒温

利用不同的方法筛选与鉴定转化子

院系： 生命科学学院

专业：生物工程

班级：10生物工程一班

姓名： 周伟竞

学号：1014200006

摘要 本文通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR、提质粒进行PCR、酶切鉴定的实验

方法，通过α-互补筛选（蓝白斑）从转化子中筛选重组子，由于pET32-CaM5 Vector上带有lacZ基因，因此可以通过菌落直接PCR的分子鉴定，可以鉴定细菌中有没有转入外源DNA；然后再挑取单菌落进行培养、提取质粒，通过凝胶电泳观察质粒的大小；最后用限制性内切酶切割大小符合的质粒，电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致。

关键词 菌落直接PCR 提质粒 酶切 鉴定

前言

通过本次的一系列实验操作，目的是为了能够筛选出含有pET32-CaM5质

粒的大肠杆菌DH5α，并进行鉴定该转化子。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点，若要克隆较小的DNA片段（<10kb）且结构简单，则质粒是最好使用的了。因为在实际操作过程中，用重组质粒转化的大肠杆菌DH5α的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。 二、摘要：

利用含有抗性的培养基从转化后代中筛选出转化子。因为不含有pET32-CaM5质粒的大肠杆菌DH5α是不能再含有抗生素的培养基上生长的，而含有重组质粒的细菌则能够在该培养基上生长，采用A mp抗性筛选，所以就

一、实验材料

菌种：某浸矿混合菌。

设备：eppendorf管、移液枪、台式高速离心机、电泳仪、水浴锅、PCR仪、无菌操作台、牙签、枪头、酒精灯。

试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、LB液体培养基、LB固体平板培养基、TE缓冲液（pH 8.0）、切胶回收试剂盒、Taq DNA polymerase，10 mM dNTPmix，引物，双蒸水，琼脂糖、溴乙锭EB、电泳缓冲液（50×TAE电泳缓冲液：取Tris 24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA（pH8.0） 20ml，加蒸馏水至100ml）、pGM-T 克隆试剂盒、Hind III、石蜡。

二、实验步骤

1 细菌基因组DNA提取 1.1 样品收集

菌种培养至OD600为1-1.5，此时1 mL 菌液中约含1.0×109细胞，用灭过菌的1.5mL离心管去菌液1 ml，室温10,000 rpm离心1 min，收集菌体。

1.2 基因组DNA的提取

（使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上的使用说明。）

1.向菌体沉淀中加入200 μl 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮； 2.向管中加入20 μl 蛋白酶K溶液，混匀；

3.加入220 μl 缓冲液GB，

质粒DNA的提取、纯化及验证

一、实验目的

1、掌握碱变性提取法质粒DNA的原理、方法及各种试剂的使用 2、掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理和方法。 二、实验材料、试剂及器具 1、材料

E.coliDH 5α（pUC 19 vector） 2、试剂

1)LB培养基 2)TE缓冲液 3)裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ 4)无水乙醇 5)70%乙醇 6）苯酚、氯仿 7)氨苄青霉素 3、器具

离心机、离心管、枪尖、移液枪 三、实验步骤 1、质粒提取

取LB平板上E.coliDH 5α（pUC 19 vector）→接种到LB+AP(20ml)培养基37℃,过夜培养→第二天早晨转接到LB+AP(50ml)培养基中，37℃，4-6h→称离心管空管重量W1，取约40ml菌液（装到离管上缘1cm处）→7000rpm离心5min→弃上清，加5ml溶液Ⅰ,涡旋打散菌泥洗涤再离心（7000rpm,5min）→弃上清，干燥，称重W2→每100ml菌泥加入溶液Ⅰ1ml,涡旋，冰浴5min→按量加入溶液Ⅱ2ml,轻加轻摇，冰浴5min→按量加入溶液Ⅲ1.5ml,轻加轻摇，冰浴10min→12000rpm,15min→转上清液至新管，加1/10V 3mol/

质粒DNA的提取、纯化与纯度鉴定

李笃财 生科

1班 201200140048

【实验目的】

1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理。 【实验原理】

1. 质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离