酵母菌原生质体的制备方法

原生质体制备方法

培养基：

① PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水

② MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、PH6.5

③ MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、0.5mol蔗糖、1L

水、PH6.5

④ MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、0.5mol

蔗糖、PH6.5

试剂：

① 1mol/L MgSO4 ② 0.5mol/L MgSO4

③ STC：0.8M 山梨醇、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ④ 肝素

⑤ SPTC：0.8M 山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ⑥ 无菌水

操作步骤：

① 倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days

② 用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG

液体培养基中，120rmp，28℃，12h

③ 以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h ④ 混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤

原生质体制备方法

培养基：

① PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水

② MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、PH6.5

③ MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、0.5mol蔗糖、1L

水、PH6.5

④ MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、0.5mol

蔗糖、PH6.5

试剂：

① 1mol/L MgSO4 ② 0.5mol/L MgSO4

③ STC：0.8M 山梨醇、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ④ 肝素

⑤ SPTC：0.8M 山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ⑥ 无菌水

操作步骤：

① 倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days

② 用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG

液体培养基中，120rmp，28℃，12h

③ 以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h ④ 混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤

拟南芥原生质体制备转化操作流程

主要试剂

1. 纤维素酶解液： 试剂

15ml酶液体系

1． 1-1.5﹪ Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225g干粉

2． 0.2-0.4﹪ Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045g干粉 3． 0.4M mannitol 1.09g干粉 4． 20mM KCl 1 ml 0.3 M KCl母液

5． 20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 6． 加入10ml 水

7． 55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂 8． 10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2

9． 5 mM β-Mercaptoethanol（可选用） 1ml 75mM β-Mercaptoethanol 母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪ BSA， 1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）

11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。

2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品

·42·

2010No．9SerialNo．222

ChinaBrewing

ResearchReport

酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究

包伟霞，王静洁，王晓斐，陈由强，许旭萍*

（农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室福建师范大学生命科学学院，福建福州350108）

摘要：研究了菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂及酶解时间等因素对酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）和马克斯克鲁维酵母菌

（Kluyveromycesmarxianus）原生质体形成与再生的影响。实验结果表明，原生质体形成与再生的最佳条件为酿酒酵母菌龄9h，采用1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解70min；马克斯克鲁维酵母菌龄8h，采用1.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解时间50min；配制酶液时渗透压稳定剂采用4%氯化钠高渗缓冲液，在稀释和配制再生培养基时则采用15%的蔗糖高渗缓冲液。关键

词：酿酒酵母；马克斯克鲁维酵母；原生质体的形成与再生

文献标识码：A

文章编号：0254-5071（2010）09-0042-03

中图分类号：TS261.1

ProtoplastformationandregenerationofSaccharo

采用3种方法对不同酵母菌的总DNA进行提取，经琼脂糖凝胶电泳、ND-1000型微量紫外分光光度计检测以及酶切、连接、预扩增试验结果的分析，表明采用改良氯化苄法提取酵母菌的总DNA质量最好，基本无DNA碎带，蛋白质污染小。通过对野生酵母菌菌株的验证试验，进一步证明采用改良氯化苄法提取的总DNA产量稳定、重复性好，可以直接用于限制性内切酶酶切试验，完全适于AFLP分析及一些其它分子生物学研究的要求方法三：酵母菌genomics/\基因组DNA的提取

一：仪器：同方法一

二：试剂：SE缓冲液（1M山梨醇，0.1MEDTA pH7.5）；溶菌酶（蛋白酶K缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5% SDS 1mM EDTA）；其余同前

三：操作

1.5ml 对数生长期细菌细胞

离心，12000rpm,1-2min

沉淀

溶于590ulSE缓冲液中混匀+10ul溶菌酶37℃,1hr

离心，12000rpm,8-10min

沉淀

溶于100μL，0.5μl蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1hr

加入1.2ml的CTAB

酵母DNA提取方法

方法一：

石英砂法

1、5000rpm×5min 收集过夜培养的菌体（5ml左右），于 200μL 裂解液(50 mmol/ L Tris-HCl pH 8.0 , 180 mmol/ LEDTA pH 8.0 , 1 % SDS , 现配)中，加入 3/10 总体积石英砂在涡流混合器上振荡 13min，每隔 4min 将离心管取出用力甩几下，然后 65℃水浴 10min。 2、加入 200μL 5mol/L KAc，冰浴 8min； 3、12000rpm×5min 转移上清至新的离心管中；

4、加入 3 mol/L NaAc 35μl，加入异丙醇 200μL混匀后冰浴 8min，12000rpm×5min收集沉淀；

5、200μL TE 溶解，加入 RNase10μL，65℃水浴 10min； 6、加入 200μL 氯仿－异戊醇（24:1）,抽提；

7、温柔地取上清 150μL ，加入 20μL 3 mol/L NaAc 及 375μL 无水乙醇，混匀后12000rpm×8min 收集 DNA；

8、70% 乙醇洗涤沉淀，吹干后 TE 溶解，-20℃保藏。

方法二：

蜗牛酶法

1. 接种于5 ml的YEPD培养基中在

植物原生质体的融合技术探析 本文关键词：质体，探析，融合，植物，技术

植物原生质体的融合技术探析 本文简介：原生质体是组成细胞的一个形态结构单位,原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的主要材料。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体,Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液,在一定条件下培养

植物原生质体的融合技术探析 本文内容：

　　原生质体是组成细胞的一个形态结构单位, 原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”, 是开展基础研究的主要材料。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体, Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液, 在一定条件下培养一段时间后, 发现大部分细胞的细胞壁被降解, 从而制备出大量有活力的原生质体。

　　1、原生质体融合的目的及意义

　　原生质体融合技术可克服不同原生质体间的排斥力, 使两种不同种属的原生质体间发生膜融合、胞质融合和核融合, 进而形成具有含两种遗传物质的杂交细胞, 克服远缘杂交的不亲和性和子代不育等障碍

水稻原生质体分离及转化

作者：植物逆境与光合实验室 | 发表日期：2014-04-11

实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验

实验材料和试剂：

生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。

溶液的配制： 母液的配制：

1、0.2 M MES(pH 5.7) 2、0.8 M Mannitol(甘露醇) 3、1 M CaCl2 4、2 M KCl 5、2 M MgCl2 6、10% BSA

[Fluka PEG 4000 81240]

以下如有上述母液，则都是使用的母液

酶解液：20 mL ×2 MES 0.5

mL

冬虫夏草

　黑龙江农业科学2006,(2):67～69

HeilongjiangAgriculturalSciences3

难栽培食用菌原生质体融合技术研究进展

邹　莉1,孟　雪1,李绍鹏1,2

(1.东北林业大学林学院,哈尔滨150040;2.大兴安岭阿龙山林业局,跟河522362)

摘要:大多数难栽培食用菌都与植物有共生或寄生关系,人工栽培出菇问题一直无法解决。原生质体融合技术是近几年来迅速发展起来的细胞工程育种技术,,实现了远缘杂交,为难栽培食用菌育种提供了新方法。,并概括了其发展前景。

关键词:难栽培食用菌;原生质体;中图分类号:S646　　::1002-2767(2006)02-0067-03

inProtoplastFusionTechnologyof

EdibleFungiCulturingDifficultly

ZOULi1,MENGXue1,LIShao2peng1,2

(1.NortheastForestryUniversity,Harbin150040;2.AlongshanForestryBureauofInnerMon2golia,DaxinganMountain,Genhe522362)

Abstract:AlotofEdiblefung

实验九 植物原生质体的分离和培养

实 验 目 的

掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。

实 验 原 理

原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。

植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原生体的材料来源。

分离愿生厦籀萨采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组麟，以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。

实 验 用 品

一、材料

1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。 2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。

二、器材

超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养