大肠杆菌分离培养注意事项

高中生物实验

生物实验技能考核教案

题 目 《大肠杆菌的分离和培养》教案 学 院___ 化学和生命科学学院 班 级___ 生物科学102班 __ _ _ 姓 名___ 杜艳花__ ___ _ _ 学 号联系电话_ _18758912261（612261） 指导老师 张萍华

日期： 2013 年 7

月 4 日

高中生物实验

《大肠杆菌的分离与培养》教案

一、实验教材分析

本节内容选自浙科版生物选修1第1部分实验1大肠杆菌的分离和培养。本次课程主要包括了本次实验的目的、大肠杆菌的特点、无菌操作和灭菌的方法、仪器设备和实验材料、实验步骤等内容。在前一节介绍了实验室规则和生物技术概况的基础上，进行具体的实验操作。并且经过生物必修三册书本的学习，学生已经掌握了一定的细菌的相关知识，并对一些特殊细菌的筛选和鉴别有了一定的了解。故本次实验教学既是对学生前面学的理论知识的深化，同时也为学生将要学到的分离以尿素为氮源的微生物等内容奠定了比较重要的基础。因此，本节课起着承前启后的重要作用。

篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲

实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲

实验目的

1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。

2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。

3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。

实验材料

1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。

2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。

实验步骤

1. 培养基灭菌。

在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。既可以通气，又不使细菌进入。)。将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。 同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。

2. 倒平板，倒斜面。

灭菌后。待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。

超净工作台操作：打超净工作台的紫外

大肠菌群测定的操作细则

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。

1.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。

1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂

2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。

2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。

2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。 2.6 生理盐水。

《大肠杆菌的分离和纯培养》的

教学设计

临沂第四中学 张园鞠 2010年7月30日 10:18

一、教材分析

微生物的实验技术是生物学最基本的实验技能，对学生来讲，它是一项实用性很强的实验技能，要求学生能独立完成微生物实验的基本操作，如：微生物实验操作中的灭菌和消毒、接种、培养分离等基本技术。

（一）、教学目标：

1、概述微生物纯培养的基本技术及原理。 2、运用划线接种法，进行微生物的分离和纯培养。 3、运用火焰灼烧法进行灭菌。 4、通过菌落特征的观察，识别微生物

（二）、教学重点

1、微生物分离和纯培养的基础知识 2、平板划线法接种技术 3、火焰灼烧灭菌法

（三）、教学难点

平板划线法接种技术

二、教学过程

这个探究活动，学生是初次接触微生物方面的内容，既不具备相应的基础知识，也缺乏相关的实验技术和操作技能，从教学目标上看，进行微生物的分离和纯培养，属于技能性目标中独立操作水平的要求，根据课标要求，考虑到学生零起点的现状，对教学活动进行如下设计：

课堂导入：展示发霉的馒头和面包给大家看。问：馒头和面包上的斑点是什么？ 答：馒头和面包霉了

（导引目标，激发兴趣。从学生熟悉的生活现象入手，自然引入新的课题。从现实生活入手提出

大肠杆菌培养操作规程

一、 目的及适用范围

制订本规程的目的为规范大肠杆菌总RNA的制备，保证为诊断试剂产品提供质量可控的质控品及标准品基质。本规程适用于南京实验室提取大肠杆菌总RNA的操作。依照本操作规程，每次可提前大约提取基质液原液2.7ml。

二、 常规时间安排 预计安排 步骤 耗材准备 PBS储存液配置 第一天 培养基配制 灭菌 领取菌种 菌种复苏 第二天 接种 分装培养 RNA完全提取根据需求，自行安排。

三、 培养用耗材准备

1、 锥形瓶、双层铝箔、棉绳

2、 包扎一盒1ml的枪头，50ml康宁冻存管

四、 培养基配制(早上)

培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。

1、 按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中： 例如：配制350mlLB培养基配方如下：[配置双份] 蛋白胨 成分名称 TRYPTONE 称取质量 3.5g 钠 3.5g YEAST XTRACT 1.75g 补足350ml 氯化酵母提取物 去离子水 耗时评估 20min 40min 20min 3h 10min 9h 40min 13h 2、 用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、

完全、溶解。待灭

大肠杆菌的分离以及药敏试验（悠然）

摘 要：山东某集团送检的疑似大肠杆菌病的病死鸡的心、肝、脾，进行病原菌的分离、鉴定和药敏试验。结果显示引起该鸡场鸡只发病的病原为大肠杆菌，对阿米卡星、新霉素敏感，对头孢和新霉素的复方制剂中度敏感，几乎对可克林霉素不敏感。表明该鸡场出现了耐药的致病性大肠杆菌，在以后的肉鸡生产中应慎用抗生素，在使用药物治疗大肠杆菌病时，应根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药。 关键词：大肠杆菌；分离鉴定；致病性；药敏试验

大肠杆菌病是由大肠杆菌某些血清型菌株引起的一类疾病的总称。各个品种和日龄的鸡均可发病，但肉仔鸡最易感。随着养禽业的迅速发展与高度集约化饲养，鸡大肠杆菌病已成为鸡群重要的疾病之一。为了控制鸡大肠杆菌在鸡群中的传播，我们对送检的疑似大肠杆菌病例进行病原的分离鉴定，并对分离菌的培养特性、致病力及抗菌药物的敏感性进行了研究，为有效防制鸡大肠杆菌病提供了依据。 1 材料与方法 1.1 病料来源

2006年11月山东省某集团养殖场场送检的疑似大肠杆菌病的病料若干，已死亡鸡只死亡时间不超过24 h。 1.2 细菌分离培养

无菌采集病、死鸡的肝脏、心血等组织，接种在普通琼脂平板及普通肉汤，37℃培

大肠杆菌培养

一、菌种冻存液的制备

含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80oC冻存。 二、培养基制备

LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）

液体培养基

胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4

固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备

1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。

2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。 3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）

大肠杆菌及其检验

大肠杆菌的生物学特性

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简介：

大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。 附：肠杆菌科各属

大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。

大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。

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形态与染色

大小0.4～0.7×1～3um,无芽胞,大多数菌株有动力。

有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，革兰氏阴性杆菌。 附：有动力是什么意思？请看动力试验。

革兰氏阴性杆菌是什么意思？请看革兰氏染色介绍。 大肠杆菌扫描电镜照片 大肠杆菌透射电镜照片 大肠杆菌分裂照片

最新： 大肠杆菌革兰氏染色照片

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培养特性

由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。

最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。

在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：

1

（1）光滑型： 菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈

文献综述

我国大肠杆菌病病原的分离与鉴定

王亚

西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌 402460

摘要：大肠杆菌病是在世界范围内影响养殖业发展的主要细菌病之一, 常招致巨大

的经济损失，有效防治大肠杆菌病一直是养殖业的一项重要课题。近几年随着我国养殖业迅速发展和集约化程度的大大提高,大肠杆菌病流行势头愈加迅速。无菌采取病死雏鸡肝、脾、肺等脏器病料，进行大肠杆菌病原的分离培养与鉴定。本综述主要从大肠杆菌病的概念与临床症状入手，梳理总结了当前有关专家学者对鸡大肠杆菌病相关内容的研究，拟从中发现研究空白，为论文的写作提供依据，以便于进一步对山东省单县鸡大肠杆菌病病原的分离与鉴定奠定基础。

关键词：大肠杆菌 分离与鉴定 药敏试验 综述

大肠杆菌病是家禽中最常见的病原菌之一。由于该病在一些养殖场中严重发生，兽医临床上抗菌药物不得不大量地被应用，导致大肠杆菌耐药菌株不断出现，耐药谱不断扩大，形成恶性循环；同时加剧了抗菌药物在畜禽体内的残留，给养禽业的持续发展和人类的身体健康带来潜在危害。目前，国内有关专家学者对大肠杆菌病做了大量的研究，涉及到的研究成果也颇为丰富，为我国鸡大肠杆菌病的研究提供了重要的理论参考。 1.大肠杆菌病的概念与临床表现

大肠杆菌

维普资讯

畜牧兽压杂志

第 2卷】

第3 期

20 0 2年

肉鸡大肠杆菌病的诊治姚忠会(南省文山州农业学校 .南文山云云 630 ) 60 0

中图分类号：5 . 1 8 8 3

文献标识码： B

文章编号：0 4 6 0 (0 Z 0 0 30 1 0— 7 4 Z 0 ) 30 4 1

Z0 0 1年 3月，山县城郊某鸡场 2 0文 0 0多只 3 0

糖、麦芽糖、甘露醇，三糖铁产酸产气、不产生 H:不 s,液化明胶，尿素酶阴性，不利用拘木酸盐，基质试验阳性， .试验阳性， P试验阴性。 M R. V3 3动物试验 .

日龄艾维因肉鸡发生以呼吸困难、喘鸣、下痢为主要症状的疫情，日死亡 1 0多只。经诊断为大肠杆菌病现报道如下：

1发病情况该鸡群在 3 0日龄时发病病鸡主要表现精神萎顿，畏寒，挤堆，翅下垂，呼吸困难，喘鸣，食废绝，饮部分鸡拉灰黄色或灰绿色稀便。发病后 3d开始出现死 亡 .日死亡 1每 O多只， d时间就已死亡 8 1 5 0几只，且

用 2 4h普通肉汤培养物，腔接种 5只小白鼠，腹 同时用灭菌肉汤接种 2只小白鼠作为对照，剂量均为00 . Zm]只种后 4/接 8 h内， 5只试验小白鼠均死亡，

2只对照小白鼠均健活；剖检可见死亡鼠心外膜有点