有关pcr的问题

一、选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。 1．以下哪种物质在PCR反应中不需要（ ）

A．Taq DNA聚合酶 B．dNTPs C．Mg2+ D．RNA酶 E．合适pH缓冲液 2．以下哪种酶可耐高温（ ）

A．Taq DNA聚合酶 B．Hind Ⅲ C．T4连接酶 D．RNA酶 E．Klenow片段 3．PCR反应正确过程应为（ ）

A．退火→变性→延伸 B．变性→退火→延伸 C．退火→延伸→变性 D．变性→延伸→退火E．延伸→变性→退火

4． PCR技术的本质是（ ）

A． 核酸杂交技术 B． 核酸重组技术C． 核酸扩增技术 D． 核酸变性技术 E． 核酸连接技术 5．Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为（ ）

A．37℃ B．50℃～55℃ C．70℃～75℃ D．80℃～85℃ E．94℃～95℃ 6．能在细胞内进行PCR扩增的PCR仪为（ ）

A．普通PCR仪 B．梯度PCR仪 C．原位PCR仪 D．荧光PCR仪 E．实时PCR仪 7．在下列哪种PCR仪扩增样品可以了解样品中DNA原始拷贝数（ ）

A．普通PCR仪 B．梯度PCR仪 C．原位PCR仪 D．荧光实时PCR仪E．定性PCR仪 8．

如何防止PCR形成引物二聚体？

在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，对照marker时都不容易看出其大小，具体是什么原因呢？PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适？

答：1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会有帮助。

PCR模板大约在104-106个拷贝。

答2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量，稀释10倍或是减少循环数。

答3：1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2. 可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致；

3. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

4. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的； 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%

如何防止PCR形成引物二聚体？

在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，对照marker时都不容易看出其大小，具体是什么原因呢？PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适？

答：1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会有帮助。

PCR模板大约在104-106个拷贝。

答2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量，稀释10倍或是减少循环数。

答3：1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2. 可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致；

3. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

4. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的； 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的D

荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

荧光定量PCR问题疑难解答（一）

Q：1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。

A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。

1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。

做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。 2. PCR中混入影响反应的物质：

模板提取方法需要改进

3. 样品稀释不准确：

正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。 这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，

Q：荧光定量PCR的灵敏度

A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。

Q：标准曲线要重复两三次吗?

A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。

课题：与圆有关的轨迹问题

2010届高三数学调研测试(二)解答题中出现这样一道题目： 18.在等腰?ABC中，已知AB?AC,且点B(?1,0)。点D(2,0)为

AC中点。

l y E A F B O D x （1）求点C的轨迹方程

（2）已知直线l:x?y?4?0,求边BC在直线l上的射影EF长的最大值。

文科班大部分学生对第一小题中的轨迹问题一筹莫展，结合

C 2010年江苏高考考试说明我们可以了解到直线和圆的知识是解析几何中的重中之重，虽然考纲中必做题部分对轨迹方程并没有明确要求，但在样卷的解答题中依然出现了轨迹方程问题，我们还是不能掉以轻心，今天我们利用一节课的时间来研究一下解析几何中简单的一些求轨迹的问题，特别是与圆有关的轨迹问题。 一．回忆解析几何中常见的轨迹:

(1)在平面内,到两定点的距离相等的点的轨迹是连接两定点的线段的垂直平分线. (2)平面内到角的两边距离相等的点的轨迹是这个角的平分线. (3)平面内到定点的距离等于定长的点的轨迹是以定点为圆心的圆.

(4)平面内到定点的距离与到定直线（定点不在此定直线上）的距离之比等于常数的点的轨迹

是圆锥曲线.当常数大于1时表示双曲线;当常数等于1时,表示抛物线;当常数大于0而小于1

五险一金，相信很多上班的人都有缴纳，2017年以来，国家对五险一金又进行了新的调整，出现了新的规定，今年的五险一金又会有怎样的变化呢?社保断交之后该怎么办?

根据人社部、财政部印发的《关于做好基本医疗跨省异地就医住院医疗费用直接结算工作的通知》，2017年开始逐步解决跨省异地安置退休人员住院医疗费用直接结算，年底扩大到符合转诊规定人员的异地就医住院医疗费用直接结算。

我国社会保险包含养老保险、医疗保险、生育保险、失业保险、工伤保险五个险种，每一项险种对于中断的规定都不一样。

一、社保断交影响

失业保险和生育保险比较方便灵活，只要在使用之前交够1年，失业保险和生育保险就可以使用。

医保断了，医保待遇从下个月起就停了，重新交还是可以报销的。医疗保险自停交之日起有3个月缓冲期，如果超过了这个期限，连续缴交年限要重新计算。此外，医疗保险一般可以中断3次，否则也要重新累计缴交年限。中断期间不享受医疗报销等一切医保待遇。

一般来说，这15年是累计计算的，中间要是断了，续上就好，但是退休待遇会有所影响。

如果到了退休年龄，还是不够最低缴费年限，即15年，那该怎么办呢?对于这种情况每个地方规定有所差别，比如，在北京有北京户口的话就可以办理延期缴费;但

（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）

⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。 ⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。

（二）琼脂糖凝胶：

商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。 （三）聚丙烯酰胺凝胶：

是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交

有关职称问题的几点说明

一、学习豫人社职称[2014]11号，宛职改办（2014）14号相关职改文件。

二、各单位参照《卧龙区中小学教师水平评价标准》，制定本单位量化考核方案。

三、各单位报送开展“公开、展示、考核、评议、监督”情况报告；量化考核方案；符合申报一级教师和高级教师人员排序名单；诚信承诺书，一式两份。

四、中小学（幼儿园）教师专业技术职务分为员级、助理级、中级、副高级和正高级，名称依次为：三级教师、二级教师、一级教师、高级教师和正高级教师。

五、（一）申报一级教师任职资格，学历与年限条件。（1）研究生毕业并获硕士学位，从事中小学（幼儿园）教育教学工作3年以上；或者研究生毕业并获硕士学位，取得二级教师任职资格并担任二级教师职务2年以上；（2）具备大学本科学历或取得硕士学位，取得二级教师任职资格并担任二级教师职务4年以上；（3）具备大学专科学历，在幼儿园、小学、初中任教，取得二级教师任职资格并担任二级教师职务4年以上；（4）具备中等师范学历，在幼儿园、小学任教，取得二级教师任职资格并担任二级教师职务5年以上。（二）申报高级教师任职

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资格，学历与年限要求：（1）研究生毕业并获硕士学位，取得一级教师任职资格并担任一级教师职务

五险一金，相信很多上班的人都有缴纳，2017年以来，国家对五险一金又进行了新的调整，出现了新的规定，今年的五险一金又会有怎样的变化呢?社保断交之后该怎么办?

根据人社部、财政部印发的《关于做好基本医疗跨省异地就医住院医疗费用直接结算工作的通知》，2017年开始逐步解决跨省异地安置退休人员住院医疗费用直接结算，年底扩大到符合转诊规定人员的异地就医住院医疗费用直接结算。

我国社会保险包含养老保险、医疗保险、生育保险、失业保险、工伤保险五个险种，每一项险种对于中断的规定都不一样。

一、社保断交影响

失业保险和生育保险比较方便灵活，只要在使用之前交够1年，失业保险和生育保险就可以使用。

医保断了，医保待遇从下个月起就停了，重新交还是可以报销的。医疗保险自停交之日起有3个月缓冲期，如果超过了这个期限，连续缴交年限要重新计算。此外，医疗保险一般可以中断3次，否则也要重新累计缴交年限。中断期间不享受医疗报销等一切医保待遇。

一般来说，这15年是累计计算的，中间要是断了，续上就好，但是退休待遇会有所影响。

如果到了退休年龄，还是不够最低缴费年限，即15年，那该怎么办呢?对于这种情况每个地方规定有所差别，比如，在北京有北京户口的话就可以办理延期缴费;但

对实时定量PCR实验中遇到的常见问题总结。

实时定量PCR中的常见问题及解决办法

1、反应后无扩增曲线出现

1）确认程序中是否设置了信号采集步骤：两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

2）扩增效率问题：电泳检测realtimePCR反应产物，观察是否有正确大小的目的条带出现。如果没有，则逐一排查引物、模板以及反应条件问题。

3）循环数不够：一般可设置循环数为40。

2、Ct值出现太晚

1）模板浓度过低或模板降解：重新制备模板再进行实验。

2）扩增效率低：优化反应条件，或者重新设计PCR引物。

3）PCR产物过长：一般设计为100-200bp即可。

4）反应体系中含有抑制剂：常在模板质量不高时出现，重新制备模板或将模板稀释后使用。

3、扩增曲线形状异常

1）扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。

2）扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。减小基线终点 (Ct值- 4)，重新分析数据。

3）个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

4、阴性对照出现扩增曲线

1）阴