激光扫描共聚焦显微镜实验报告

激光扫描共聚焦显微镜技术

Laser Scanning Confocal Microscope

——基础篇 李治国

细胞的内在生活 显微镜的发展史

没有显微镜就不可能有细胞学诞生。

1590年，荷兰眼镜制造商J和Z.Janssen父子制作了第一台复式显微镜。

1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓)，命名为cella。

1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。

Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723). Magnification ranges at 50-275x. 显微镜的最重要参数 ——分辨力

显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。

分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 各种显微镜的分辨能力

光学显微镜（light microscopy）0.2μm

电子显微镜 (Electro microscopy) 0.2nm

激光共聚焦扫描显微镜操作规程

一．

开机程序

1．开启总电源，确认所有仪器电源状态正常工作

2．开启电脑，双击桌面上的LSM510图标，开启显微镜。 3．在初始平面上点击Start Expert Mode 键开启专家拍摄模式。 4．在主菜单中点击File New键，建立新的数据库。 二．

软件拍摄

1．在主菜单上点击Acquire Laser键，开启需要使用的激光 2．在主菜单上点击VIS键，开启显微镜观察模式 3．把需要观察的玻片放到载物台上选择需要观察的平面 4．在主菜单上点击LSM键，开启进入显微镜激光扫描模式 5．在主菜单上点击Config键，选择所需要扫描的模式及参数 6．在主菜单上点击Scan Find键，进行图像参数自动校正 7．在Scan子菜单下点击Fast X键，进行层面选择

8．在连续扫描中调节放大器增益、补偿；激光强度等图像参数来优化图像 9．点击图像子菜单上的Save键存储优化好的图像 三．

关机程序

1．完成所有操作后，关掉激光开关，冷却5分钟后，点击主菜单上Exit键，退出所有程序 2．关闭电脑 3．关闭电源

ZEISS 510 META二维扫描程序

1. 在Acquire → config → 确定扫描所需的波

为适应三维光学微细加工及三维光学信息存储研究的需要,研制了共聚焦激光扫描荧光显微镜的工作台式扫描系统,扫描范围138μm×138μm。

第10卷　第6期2002年12月

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Dec.　2002OpticsandPrecisionEngineering

光学　精密工程

Vol.10　No.6

文章编号　1004-924X(2002)06-0582-06

共聚焦激光扫描荧光显微镜扫描系统研制

周拥军,陈德强,黄文浩,夏安东

1

1

1

1,2

(1.中国科学技术大学精密机械及精密仪器系,安徽合肥230026;

2.中国科学院化学所分子反应动力学实验室,北京100800)

摘要:为适应三维光学微细加工及三维光学信息存储研究的需要,研制了共聚焦激光扫描荧光显微镜的

工作台式扫描系统,扫描范围138μm×138μm。工作台采用压电陶瓷驱动器(PZTactuator)驱动的方式来获得高分辨率的位移,采用带柔性铰链的杠杆放大装置来获得较大的位移范围。描述了工作台的工作原理,并对其静态和动态性能进行了测试,实验表明这一扫描系统能很好的应用于共聚焦激光扫描荧光显微镜系统。关　键　词:共焦显微镜;压电陶瓷驱动器;柔性铰链中图分类号:TH742.64

胰腺细胞悬浮液样品 适当离心后加入荧光染色剂，用专业的细胞培养皿，中间凹陷，可在激光共聚焦载物台上拍片，扫描，观察钙离子变化情况

目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化

原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为0.1 umol/L，胞外钙离子浓度为

1.2-1.3 mmol/L，相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见，测定[Ca2+]在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。

Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。

方法：

1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1 mmol/L原液，-20℃避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10 umol/L，并加入0.1%的Pluronic

F-127备用。

2.移去培养皿中的原培养液，用

胰腺细胞悬浮液样品 适当离心后加入荧光染色剂，用专业的细胞培养皿，中间凹陷，可在激光共聚焦载物台上拍片，扫描，观察钙离子变化情况

目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化

原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为0.1 umol/L，胞外钙离子浓度为

1.2-1.3 mmol/L，相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见，测定[Ca2+]在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。

Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。

方法：

1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1 mmol/L原液，-20℃避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10 umol/L，并加入0.1%的Pluronic

F-127备用。

2.移去培养皿中的原培养液，用

近代物理实验 扫描隧道显微镜

近代物理实验报告

扫描隧道显微镜

学 院 数理与信息工程学院 班 级

姓 名

学 号

时 间

近代物理实验 扫描隧道显微镜

摘要：本实验我们将从了解扫描隧道显微镜原理出发，熟悉各部件的工作原理和功用，掌握描隧道显微镜的操作和调试过程，通过对隧道效应和样品表面的形貌观测初步体会描隧道显微镜在微观观测和操作领域的重要作用，学会用计算机软件处理原始图象数据。 关键词：工作原理 工作模式 仪器构成 操作方法

0 引言：

社会发展、科技进步总伴随着工具的完善和革新。以显微镜来说吧，发展至今可以说是有了三代显微镜。这也使得人们对于微观世界的认识越来越深入，从微米级，亚微米级发展到纳米级乃至原子分辨率。1982年，IBM瑞士苏黎士实验室的葛·宾尼（G．Binning）和海·罗雷尔（H．Rohrer）研制出的世界上第一台扫描隧道显微镜（简称STM）已达纳米级别。STM使人类第一次能够实时地观察单个原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物化性质，在表面科学、材料科学、生命科学等领域的研究中有着重大的意义和广泛的应用前景，被国际科学界公认为20世纪80年代世界十

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围

激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和 装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。

1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM ）的原理

从基本原理上讲, 共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜, 它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:

1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好, 光源波束的波长相同, 从根本上消除了色差。

1． 2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板, 将焦平面以外的杂散光挡住, 消除了球差; 并进一步消除了色差

1． 3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点, 用十分细小的激光束(点光源 逐点逐行扫描成像, 再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的, 标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密

STM的原理及其应用

摘要：近年来，人类在纳米科技领域内的研究取得了引人瞩目的成就。而扫描隧道显微镜（STM）是纳米科技发展的重要基础。STM系统的出现首次成功实现了对原子实际空间图像的观察，促进了人类对微观领域的认知，推动了纳米科技的发展。本文主要介绍了STM的原理、系统结构极其应用。

1 扫描隧道显微镜（STM）的概述[1,2,3]

1.1 扫描隧道显微镜（STM）的发展

1982年，国际商业机器公司苏黎世实验室的葛·宾尼（Gerd Binnig）博士和海·罗雷尔（Heinrich Rohrer）博士及其同事们共同研制成功了世界第一台新型的表面分析仪器——扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope,以下简称 STM）。它的出现，使人类第一次能够实时地观察单个原子 在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理、化学 性质，在表面科学、材料科学、生命科学等领域的研究中有着重大的意义和广阔的应用前景，被国际科学界公认为八十年代世界十大科技成就之一，为表彰STM的发明者们对科学研究的杰出贡献，1986年宾尼和罗雷尔被授予诺贝尔物理学奖。而在1988年，白春礼成功研制了国内第一台计算机控制、有数据分析和图像处理系统

近代物理实验 实验报告

实验名称：原子力显微镜 所在学院：物理与电子学院 专业班级：物理升华班 学生姓名：黄佳清 学生学号： 指导教师：黄迪辉

1301 0801130117

一、 目的要求

(1) 了解原子力显微镜的工作原理。

(2) 初步掌握用原子力显微镜进行表面观测的方法。

二、实验原理

1.基本原理

AFM是利用一个对力敏感的探针针尖与样品之间的相互作用力来实现表面成像的，工作原理如图1所示。将一个对微弱力极敏感的弹性微悬臂一端固定，另一端有一微小的针尖，针尖与样品的表面轻轻接触，由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的作用力（10-8～10-6 N），微悬臂会发生微小的弹性形变。针尖和样品之间的力F与微悬臂的形变△z之间遵循胡克定律（Hooke Law） F = k·△z

其中，k为微悬臂的力常数。测定微悬臂形变量的大小，就可以获得针尖与样品之间作用力的大小。针尖与样品之间的作用力与距离有着强烈的依赖关系，所以在扫描过程中利用反馈回路保持针尖和样品之间的作用力恒定，即保持微悬臂的形变量不变，针尖就会随表面的起伏上下移动。记录针尖上下运动的轨迹即可得到样品表面形貌的信息。这种检测方式

实验二 特殊显微镜的使用

实验2.1相差显微镜

一、实验目的

掌握相差显微镜的原理、构造及其使用方法。 二、实验原理

相差显微镜（phase-contrast microscope）是由P. Zernike于1932年发明的，P. Zernike于1953年获诺贝尔物理奖。相差显微镜最大的特点就是可以用于观察未经染色的标本和活细胞。

人们在光学显微镜下观察被检标本时，只有在反射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，方能看到被检样品的结构。活细胞近于无色透明，光波通过时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。一般对于明暗对比很小的样品，多借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，才能识别。但有些样品一经染色就会引起变形，染色也可使有生命的样品死亡。我们可以利用相差显微镜来进行观察。相差显微镜利用了光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，因此它是一种应用在染色困难或不能染色的新鲜标本上获得高对比图像的新型显微镜。

相差方法应用于生物学上的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。