超氧化物歧化酶sod测定方法

植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法

【实验目的】

1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。 2. 熟悉植物叶片中ROS去除机制。 【实验原理】

超氧化物歧化酶（SOD）普遍存在于动植物与微生物体内。SOD是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD：Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。SOD能够清除超氧阴离子自由基 （O2—），它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。

超氧阴离子自由基（O2—）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和O2。生成的H2O2可被过氧化氢酶分解为O2和H2O：

2 O2—+ 2H+ H2O2+O2 2 H2O2 CAT O2+H2O

SOD

超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD活性。本实验依据SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2—。当加入NBT后，在光照条件下O2—又可将NBT还原为蓝色的甲腙，后者在5

SOD

超氧化物歧化酶（ 超氧化物歧化酶（SOD） ）

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全球瞩目的生物奇葩 现代生命科学的新宠

超氧化物歧化酶（SOD） 超氧化物歧化酶（SOD）

英文Superoxide Dismutase的缩写，其化学性 英文 的缩写， 的缩写 质为蛋白质（金属类）源自生命体的活性物质， 质为蛋白质（金属类）源自生命体的活性物质，是体 内对抗自由基的第一道防线。是由含109个和 个和119个 内对抗自由基的第一道防线。是由含 个和 个 氨基酸的两个肽链组成。 氨基酸的两个肽链组成。主要作用是清除氧自由基和 体内垃圾。当我们身体吸入氧气进行新陈代谢， 体内垃圾。当我们身体吸入氧气进行新陈代谢，就会 产生超氧阴离子自由基，若不予以消除， 产生超氧阴离子自由基，若不予以消除，会在体内产 生连锁反应，破坏我们的细胞， 生连锁反应，破坏我们的细胞，是人体老化及疾病的 元凶。 元凶。

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SOD-不老物质 震惊世界的发现！ 不老物质—震惊世界的发现 不老物质 震惊世界的发现！

30年代keilie（凯林） 和Mann（盖尔曼） 剑桥大学 1998年 罗伯、费瑞和洛伊格纳洛 诺贝尔生理医学奖 1969年Mc

超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术

证明SOD提取过程工艺不同浓度的硫酸铵对纯化SOD蛋白酶的效果

的综合影响

一、摘要：

通过对绿豆的研磨破碎获得SOD粗酶，经过(NH4)2SO4分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶中的杂质及干扰蛋白。

二、关键词：

SOD 连苯三酚自氧化法 SOD酶活性测量 透析除盐

三、前言：

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶.它是一种源于生命体的活性物质，SOD是机体内危害最大的氧自由基专一清除剂，亦是其他自由基最有效的清除剂，它与体内的谷胱甘肽过氧酶、过氧化氢酶联手，把自由基转化为水和氧分子。能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果。本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

四、实验技术路线：

我们的这次试验主要的路线是通过测定经过不同浓度的硫酸铵分离出来的不同的SOD蛋白的上清和沉淀，以此来确定硫酸铵沉淀SOD酶和其他杂蛋白的一个大致区间

大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶的分离纯化

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食品与发酵工业

F o n emett n Id sr s o da dF r nai n ut e o i

Vo.9 N . 12 o 2

大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶的分离纯化艘蠲

谢岩黎，

李元瑞

l西北农林科技大学食品科学与工程学院，凌， 1 1 0 (杨 720 ) 2河南职业技术师范学院食品科学与工程系，乡，5 0 3 (新 4 30 )

摘

要

采用热变性、乙二醇 ( E 60聚 P G)0 0沉淀作用和 D AE纤维素柱层析 3种方法对大 E一

蒜细胞溶质中的超氧化物歧化酶进行分离纯化。经过 3步分离纯化， 5 0大蒜中得到从 0g 1 . mg产品，活为 31 5 5 rg酶的类型是 C nS 56比 4 . a。 U/ u Z -OD,紫外区的最大吸收峰是 2 8在 5nm o

关键词

大蒜细胞溶质，超氧化物歧化酶，分离纯化

超氧化物歧化酶 (u eo ieds ts, sp rxd i muae S oD)一种具有清除体内超氧自由基 ( -是 02

1 3试验设备 .

uv一 1 0紫外一见分光光度计、速冷 10可高冻离心机 ( u o tRC 5 )恒温水浴锅、 D P n 一C、核酸蛋

.

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法

一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。网上说定容到100ML我也不懂。拜托

（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；

（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法

一、 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。网上说定容到100ML我也不懂。拜托

（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml； （4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100m

A液：0.2 mol/L Na2HPO4-12 H2O 71.64g定容至1000ml B液：0.2 mol/L NaH2PO4-2H2O 31.2g定容至1000ml 1、超氧化物歧化酶SOD活性测定

0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)取A液228.75ml，B液21.25ml定容至1000mL。 130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100mL

750u mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100mL，用前配避光 100u mol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000mL。用前配置，避光保存。

20u mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，用前配置，避光 2、过氧化物酶POD活性测定

愈创木酚、30%过氧化氢、

100m mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：分别取贮备液A：0.2 mol/L Na2HPO4 6.15mL溶液与贮备液B ：0.2 mol/L NaH2PO4溶液43.85mL充分混匀定容至100mL。

20m mol/L KH2PO4：

叶绿体的提取

一、试剂配置

1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl（0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO（0.0005=0.1g）；4200×使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）; 2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）； 3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；

实际配制：

PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),

悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;

80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）

二、提取步骤

1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

1、碱金属氧化物的作用

当碱金属氧化物加入于熔融石英玻璃中，使玻璃结构疏松、减弱，导致一系列性能变坏。如热膨胀系数上升、电导和介电损耗，弹性模数、硬度、化学稳定性和粘度等下降。

主要表现于（当取代Na+或K+时）能提高玻璃的化学稳定性、表面张力和析晶能力。它具有高温助熔、加速玻璃熔化的作用。 2、二价金属氧化物的作用 玻璃的折射率、密度、热膨胀系数，随Ra2+离子半径增大而上升，硬度随半径增大而下降。此外，二价金属氧化物对碱金属氧化物有“压制效应”

常用的二价金属氧化物的作用分述如下： 一、氧化钙（CaO)

Ca2O有极化桥氧和碱弱硅氧键的作用，这可能是它降低玻璃高温粘度的原因之一。玻璃CaO含量过多，一般使玻璃的料性变短。脆性增大，在硼硅酸盐玻璃中CaO一般不加或少加，否则玻璃的析晶倾向增大，在钠钙硅玻璃中若以MGO取代CaO，将使玻璃结构疏松，导致玻璃的密度、硬度下降，钠钙硅玻璃中常以MGO取代部分CaO以降低玻璃析晶能力和调整玻璃的料性。含镁玻璃在水和碱液作用

下，玻璃表面易于形成硅酸镁薄膜。因此目前保温瓶和瓶罐玻璃都趋于少用或不用氧化镁