免疫组织器官切片及免疫细胞观察实验报告

第十一章 抗原提呈细胞与抗原的处理及提呈

一、是非题

1.IL-8是由活化巨噬细胞产生的对巨噬细胞具有趋化和激活作用的细胞因子（ ） 2.巨噬细胞既具有杀菌作用又有抗原加工提呈作用。（ ）

3.NK细胞表面的杀伤细胞抑制受体可识别自身组织细胞表面的MHCⅡ类分子。（ ） 4.B-1B细胞主要分布于淋巴结浅皮质区淋巴滤泡中。 （ ） 5.树突状细胞除了表达FcγRⅡ受体外，还表达甘露糖受体。（ ） 6.巨噬细胞、B细胞、树突状细胞和内皮细胞都是抗原递呈胞。（ ）

7.树突状细胞能够显著刺激已活化的或记忆性T细胞增殖，而巨噬细胞、B细胞仅能刺激初始型T细胞增殖。（ ） 8.巨噬细胞递呈抗原给T细胞受MHC-Ⅰ类抗原的限制。（ ）

9.髓系来源的树突状细胞和淋巴系来源的树突状细胞的区别在于前者前体能分化发育为吞噬细胞，而后者前体能分化为淋巴细胞。（ ） 10.外源性抗原被摄取后主要通过MHCⅡ类途径加工处理和提呈，内源性抗原主要通过MHCⅠ类途径加工处理和提呈，但也存在交叉提呈现象。（ ） 二、填空题

1.参与固有免疫的细胞主要包括________、_________、_________和_____

第二章 免疫器官和组织

免疫系统（immune system）是机体执行免疫应答及免疫功能的一个重要系统。免疫系统由免疫器官和组织、免疫细胞（如造血干细胞、抗原提呈细胞、淋巴细胞、NK细胞、粒细胞、肥大细胞、红细胞等）及免疫分子（如免疫球蛋白、补体、各种细胞因子和膜分子等）组成。本章重点介绍免疫器官和组织的结构与功能，免疫细胞和免疫分子将在后续相关章节介绍。

免疫组织（immune tissue）又称为淋巴组织（lymphoid tissue）。淋巴组织在人体内分布广泛，其中胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道等黏膜下含有大量非包膜化的弥散淋巴组织（diffuse lymphoid tissue）和淋巴小结（lymphoid nodule），在黏膜局部抗感染免疫中发挥主要作用。淋巴组织是胸腺、脾、淋巴结等包膜化淋巴器官（lymphoid organ）的主要组分。淋巴器官因具有免疫功能，又被称为免疫器官（immune organ）。

免疫器官按其发生和功能不同，可分为中枢免疫器官和外周免疫器官（图2-1），二者通过血液循环及淋巴循环互相联系。中枢免疫器官发生较早，由骨髓和胸腺组成，多能造血干细胞在中枢免疫器官发育为成熟免疫细胞，并通过血液循环输送至外周

细胞爬片免疫荧光实验步骤

第一天：

1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；

3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；

4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；

5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；

第二天：

6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

细胞免疫荧光步骤

1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。10000-30000左右

2.给药处理24h

Western blot实验报告

摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法 方法：western blot 结果：见后文

结论：western blot能很好地分离蛋白 关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白

Western blot test report

Abstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transfer Results: see below

Key words: Western blot、separate、mouse tissues、protein

前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术

相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相

学习目标 掌握 HSC功能特征 掌握阳性和阴性选择的生物学意义 罗列 T 、 B 细胞的主要表面标志，并掌握其功能:-TCR-CD3 complex; -BCR complex; -coreceptors; -co-stimulatory molecules and co-stimulatory receptors

掌握T、B细胞的分类方法与功能 掌握 NK 细胞的特点

I 免疫系统:

概述

Tissues and organs Cells Molecules

免疫细胞的类型Cells of adaptive immune systemAntigen specific lymphocytes (T,B cells) Antigen presenting cells抗原提呈细胞

Cells of innate immune systemMononuclear phagocytes 单核-巨噬细胞 Granulocytic cells 粒细胞 Mast cells 肥大细胞 Natural killer cells 自然杀伤细胞 Platelets 血小板4

Hematopoietic Stem Cell (HSC ) 造血干细胞 H

冰冻切片免疫组化步骤

1. 需要准备的材料

APES包被的载玻片 PBS（pH7.4） 4%多聚甲醛

PBST（含Tween-20）

PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸）

2. 冰冻切片

取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。

切片厚度4-8 um (5 um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。

切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。

3. 免疫组化染色步骤

固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。

打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含0.25% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。

封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚

学习目标 掌握 HSC功能特征 掌握阳性和阴性选择的生物学意义 罗列 T 、 B 细胞的主要表面标志，并掌握其功能:-TCR-CD3 complex; -BCR complex; -coreceptors; -co-stimulatory molecules and co-stimulatory receptors

掌握T、B细胞的分类方法与功能 掌握 NK 细胞的特点

I 免疫系统:

概述

Tissues and organs Cells Molecules

免疫细胞的类型Cells of adaptive immune systemAntigen specific lymphocytes (T,B cells) Antigen presenting cells抗原提呈细胞

Cells of innate immune systemMononuclear phagocytes 单核-巨噬细胞 Granulocytic cells 粒细胞 Mast cells 肥大细胞 Natural killer cells 自然杀伤细胞 Platelets 血小板4

Hematopoietic Stem Cell (HSC ) 造血干细胞 H

细胞免疫荧光染色

1. 盖玻片处理：用前1天用纱布擦净灭菌，放入6孔板。

2. 接种细胞：较低密度为适宜，约2000－10000个/孔（根据细胞生长状态决定，常用

5000个/孔），2ml（浓度为2500/ml）

3. 24h后细胞贴壁，根据需要同步16－18h，干预处理，细胞融合60－70％时染色最

佳

4. 37度PBS洗涤，3ml/孔，贴边加（可将6孔板倾斜，加完样在放正以防冲掉细胞，

0.5min。室温PBS也可，但4度禁止，否则细胞易皱缩。

5. 固定：4％多聚甲醛(1ml)，先常温稳定5min，然后4度，10min，（可放在饭盒内）。 6. 吸掉多聚甲醛，迅速加PBS 5ml/孔，洗涤5min×3次，镜下观察，细胞形态如前。 7. 透化：0.1％－4％triton×－100，1ml/孔，室温透化5min（triton是去污剂，目的是

将脂质成分破坏，如细胞膜、核膜等，故不影响实验结果，可不用洗涤）

8. 5％BSA（滤过）室温封闭至少20min（可配制含5％BSA和0.2％triton的混合液，将

两步合成一步）风干

9. 用5％BSA将一抗1：50或1：100（常用）稀释至EP管 200ul/玻片 10. 将纱布垫在饭盒中，去离子水润湿纱

　　我们知道，我们的身体是一个由细胞构成的王国，极其精密复杂，同时又高度有序。任何伟大的王国都既需要能干建设者，也需要勇猛防卫兵，我们身体细胞王国也不例外。

　　两者功能有什么不同

　　当我们的人体还在成长时，干细胞是细胞王国的建设者，通过分化源源不断提供新生细胞，增加我们身体细胞的数量;当我们成年后身体不再成长，干细胞又会扮演细胞王国的维护者，及时替换和更新衰老或受损的细胞。

　　干细胞是建设者

　　当有外敌入侵，如细菌和病毒，免疫细胞就会扮演细胞王国的军队，快速反应，将其清除。如果细胞王国中出现叛变分子，如正常细胞突变为癌细胞，免疫细胞就会扮演安保系统，将其识别并清除。

　　免疫细胞是防卫者

　　当外敌入侵过多，或王国内叛变分子太多，免疫细胞没有能力全部清除时，我们的身体就会生病。

　　两者如何分类

　　现在，让我们来进一步分别了解干细胞和免疫细胞，他们都分哪些种类，不同种类功能有何差异：

　　(1)按照分化潜能分类，干细胞分为：全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。

　　如果把人体比喻为一棵树，深埋大地的种子就是全能干细胞，就如同种子可以发育成长为一颗参天大树。

　　大树的主要枝干可以比喻为多能干细胞，如脐带/胎盘间充质干细胞，可以向

免疫层析实验

1．原理

金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DICA）是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。本项技是将各种反应试剂分点固定在试纸条 上，检测标本加在试纸条的一端，通过毛细血管作用使样品溶液在层析材料上泳动，样本中的待测物与层析材料中的反应试剂发生特异性结合反应，形成的复合物被 富集或固定在层析条上的特定区域（检测线），通过标记免疫技术显色。本项技术的特点是可进行单份标本检测且简便、快速、不需任何仪器设备，因此，发展非常 迅速。

DICA也是GICA（goldimmunochromatography assay）GICA试剂为试纸条形式。在以塑料条上依次黏贴上以下几种组分，1--吸水纸，2--破璃纤维膜，抹上固定着干燥的金标抗体，3--硝酸纤维素膜，膜上包被着线条状抗体，4--吸水纸。

因为1，4都是吸水纸，由于吸水作用， 一，使样品液从1端向4端移动

二，当样品液达到2时，金标抗体被溶解，同时与标本中的抗原反应形成复合物 三，样品液继续移动至3 时，金标记的抗体复合物与膜上的抗体结合，呈现红色的线条

四，多余的金条抗体继