测序峰图常见分析

测序常见峰图及原因说明

1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ 2. 什么是碱基缺失？ 3. 什么是引物不纯？

4. 重复结构对测序有哪些影响？ 5. 什么是模板不单一？

6. Poly结构的测序结果是怎样的？

7. 含有回文结构的模板测序结果是怎样的？ 8. 测序峰图为前双峰的结果是什么样的？ 9. 测序峰图为后双峰是什么样的？

10. 无信号的结果：信号值(ATGC的平均值)皆小于100

11. 飘峰：这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移 12. 没有任何干扰的结果

Q-1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ 返回顶端 A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大 小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是，高质量的 PCR产物才可能得到高质量的测序结果，如果您对PCR产物的纯度不很确定，希望您可以将PCR产物进行克隆处理，以确保得到好的测序结果。以下图为例： 该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。 查看大图

解决办法：改变PCR条件，重新扩增。或者可以将该

测序常见问题及其分析 Collected by RobertoRun,12.10.2008

(From: http://biology.aweb.com.cn/news/2007/9/5/14270898.shtml)

HTUTU

UUTTH

1、PCR产物测序时出现重叠峰

问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）

图1-1

图1-2

解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）

图2

解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）

测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的

测序常见问题及其分析 Collected by RobertoRun,12.10.2008

(From: http://biology.aweb.com.cn/news/2007/9/5/14270898.shtml)

HTUTU

UUTTH

1、PCR产物测序时出现重叠峰

问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）

图1-1

图1-2

解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）

图2

解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）

测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的

常见载体的测序引物：

Primer of Vector:

Vector：Primer(F)；Primer(R)

pACT T7 T3

pACT2 GAL4 AD pACT2-R

pAS2-1 GAL4 BD pAS2-1.R

pB42AD pB42ADF pB42ADR

pBACPAK8 BAC1 BAC2

pBK-CMV T7 T3

PBS(SK/KS)/M13- M13F/T7 T3/M13R

pBV220 PBV220F PBV220R

pCAMBIA 1301(1300) P1 P2

pCAMBIA 2300 M13R(-48) M13F(-47)

PCANTB5E S1/M13R S6

pCAT3-enhancer RVP3 此载体无反向引物

pcDNA3.0 CMV-F/T7 SP6/BGH

pcDNA3.1 T7 BGH

pcDNA4 T7/CMV-F BGH

pcDNA6 T7/CMV-F(J21025在T7前面） BGH

pcDNAII T7 SP6

pCE2.1 M13F M13R

pCEP4 pCEP-F EBV-R

pCF-T M13F M13R

pCI T7（17Base） 此载体无反向引物

pCI-neo T7（1

注：JHD为溶剂本身得其她1H对与之相对应得１H之间得耦合常数,JＣD为溶剂本身1H对1３Ｃ得耦合常数，H2O与交换了Ｄ得HＯD上得1Ｈ产生得即水峰得化学位移

氯仿:小、中小、中等极性

DMＳO:芳香系统(日光下自然显色、紫外荧光)。对于酚羟基能够出峰。芳香化合物还就是芳香甙,都为首选。

吡啶：极性大得,特别就是皂甙

对低、中极性得样品,最常采用氘代氯仿作溶剂,因其价格远低于其它氘代试剂。极性大得化合物可采用氘代丙酮、重水等。

针对一些特殊得样品,可采用相应得氘代试剂：如氘代苯(用于芳香化合物、芳香高聚物) 、氘代二甲基亚砜(用于某些在一般溶剂中难溶得物质) 、氘代吡啶(用于难溶得酸性或芳香化合物)等。

丙酮：中等极性

甲醇:极性大

氯仿—甲醇:

石：乙5；1小极性

石:丙2：1——1:１中等极性

氯仿:甲醇6:1极性以上含有一个糖

2：1 含有两个糖

含有糖得三萜皂甙:一般用吡啶

?常见溶剂得化学位移

常见溶剂得1H在不同氘代溶剂中得化学位移值

常见溶剂得化学位移

常见溶剂得13C在不同氘代溶剂中得化学位移值

常见分布的期望和方差

x n

(0,1)

N()

概率与数理统计重点摘要

1、正态分布的计算：()()()X F x P X x μ

σ-=≤=Φ。

2、随机变量函数的概率密度：X 是服从某种分布的随机变量，求()Y f X =的概率密度：()()[()]'()Y X f y f x h y h y =。（参见P66～72）

3、分布函数(,)(,)x y

F x y f u v dudv -∞-∞=??具有以下基本性质：

⑴、是变量x ，y 的非降函数；

⑵、0(,)1F x y ≤≤，对于任意固定的x ，y 有：(,)(,)0F y F x -∞=-∞=； ⑶、(,)F x y 关于x 右连续，关于y 右连续；

⑷、对于任意的11221212(,),(,),,x y x y x x y y <<　

　，有下述不等式成立： 22122111(,)(,)(,)(,)0F x y F x y F x y F x y --+≥

4、一个重要的分布函数：1(,)(arctan )(arctan )23

x y F x y πππ2=++22的概率密度为：22226(,)(,)(4)(9)f x y F x y x y x y π?==??++ 5、二维随机变量的边缘分布：

边缘概率密度

Q：为什么我在测序报告上找不到我的引物序列？ A：这里分以下几种情况：

1. PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3'末端后第一个碱基开始的，而且刚刚开始的碱基由于在毛细管电泳中不能很好地分离而导致准确性下降，所以找不到您的引物序列。

对于较短的PCR产物（<600 bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。

对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。

由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。

2. 有时质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外源片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时也找不到引物序列。

3. 找不到克隆片段的扩增引物。发生这种情况原因有2个：

（1）您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分会不十分准确。比如pBluescript Ⅱ KS这个质粒如果采用Sac I做工具酶，采用T7引物测序：

那么从T7引物末端到 Sac I的酶切位点只有6个bp，这样酶切位点后的扩增引

园林植物

地被植物

草本地被植物

白穗花

蚌兰

彩叶草

长春花

车前草

红花酢浆草

大吴风草

宽叶韭

地被菊

二月兰

葱兰

宿根福禄考

虉草

海石竹

红龙草

绿苋草

虎耳草

吉祥草

金球亚菊

堇菜类

景天属(直立型)

美花落新妇

半枝莲

马利筋

麦冬类和沿阶草类

大花美人蕉

白花三叶草

水鬼蕉

莓叶委陵菜

小冠花

常夏石竹

萱草

玉簪

玉竹

鸢尾类

紫锦草

黄帝菊

桔梗

秋水仙

美女樱

园林植物

灌木类地被植物

变叶木

技桑

正水

杜鹃

福建茶

龟甲冬青

红背桂

红花木继木

红桑

黄榕

雀舌黄杨

夹竹桃

金露花

金叶莸

金叶洗

翅荚决明

蓝雪花

六月雪

龙船花

美蕊花

小蜡树

铺地柏

狭叶十大功劳

希茉莉

红果仔

小檗

小驳骨丹

粉花绣线菊

野牡丹类

圆柏

月季

栀子

紫金牛

铁海棠

细叶萼距花

马缨丹

芙蓉菊

山茶

藤本及攀缘地被植物

常春藤

垂盆草

地瓜榕

园林植物

扶芳藤

合里芋

番薯

活血丹

络石

马蹄金

蔓长春

蔓花生

三裂蟛蜞菊

穗序木蓝

蛇莓

蔓马缨丹

珍珠菜

矮生竹类地被植物

菲白竹

箬竹

花坛及花坛植物

二年生花坛植物

矮牵牛

矮雪轮

百日草

白晶菊

报春花

波斯菊

雏菊

翠菊

待宵草

东方罂粟

何氏凤仙

花烟草

黄帝菊

霍香蓟

鸡冠花

金鱼草

金盏菊

毛地黄

美女樱

园林植物

南非万寿菊

还阳参

千日红

随意草

三色堇

三色苋

红花鼠尾草

四季秋海棠

穗冠

天人菊

甜菜

万寿菊

夏堇

香雪球

新几内亚风仙

勋章菊

一串红

虞美人

羽扇豆

羽衣甘蓝

紫罗兰

紫茉莉

醉蝶花

瓜叶菊

金鸡菊

卷耳

孔雀草

向口葵

喜林革

花菱草

观赏

常见分子构型及杂化方式

分子或离子 配位原子数 孤电子对数 杂化方式 VSEPR模型名称 立体构型

H2O 2 2 SP3 正四面体 V形 NH2－ 2 2 SP3 正四面体 V形 NH3 3 1 SP3 正四面体 三角锥形 H3O+ 3 1 SP3 正四面体 三角锥形 CH4 4 0 SP3 正四面体 正四面体形 NH4+ 4 0 SP3 正四面体 正四面体形 SiCl4 4 0 SP3 正四面体 正四面体形 SO32- 3 1 SP3 正四面体 三角锥形 SO42－ 4 0 SP3 正四面体 正四面体形 PO43－ 4 0 SP3 正四面体 正四面体形 CHCl3 4 0 SP3 正四面体 四面体形 SO2 2 1 SP2 平面三角形 V形 BF3 3 0 SP2 平面三角形 平面三角形 SO3 3 0 SP2 平面三角形 平面三角形 CO32－ 3 0 SP2 平面三角形 平面三角形 NO3－ 3 0 SP2 平面三角形 平面三角形 NO2－ 2 1 SP2 平面三角形 V形 CO2 2 0 SP 直线形 直线形 BeCl2 2 0 SP 直线形 直线形 HCN 2 0 SP 直线形 直线形

ABn型分子空间构型快速判断方法：

1.

常见分布的期望与方差的计算

这些分布的期望和方差要求同学们熟记，以下是计算过程，供课下看。

1.0－1分布

已知随机变量X的分布律为

X

10

p

p1 p

则有

E(X)=1 p+0 q=p,

D(X)=E(X2) [E(X)]

2

=12

p+02

(1 p) p2

=pq.

2.二项分布

设随机变量X 服从参数为n, p 二项分布,

(法一)设Xi为第i 次试验中事件A 发生的次数，i=1,2,",n则

X=∑Xi

i=1

n

n

显然，Xi 相互独立均服从参数为p 的0－1分布，

所以E(X)=∑E(Xi)=np.

i=1

D(X)=∑D(Xi)=np(1 p).

i=1

n

(法二) X的分布律为 n k P{ X= k}= p (1 p )n k, ( k= 0,1,2,", n), k n n n k则有 E ( X )=∑ k P{ X= k}=∑ k p (1 p )n k k=0 k k=0kn!=∑ p k (1 p )n k k= 0 k ! ( n k )! np( n 1)!=∑ p k 1 (1 p )( n 1) ( k 1) k=1 ( k 1)![( n 1) ( k 1)]!n n

( n