蛋白酶酶活力测定方法

水产动物酶活性测定方法

一、分析样品的采取与处理

每箱随机各取3尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4℃冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入—26℃冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。 二、酶液的制备

将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml，4℃冷却去离子水稀释，4℃下离心20min（13，000g），上清液标号分装，并与4℃冰箱中冷却保存，24Hr待测。

将肝胰脏及肠道组织用4℃去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。按样品重量加10倍的4℃冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm匀浆玻璃管外设冰浴）。匀浆液在4℃下离心20分钟（13，000g），上清液标号分装，并于4℃冰箱冷却保存，24Hr内测定完毕。

酶粉及饲料：

取2．0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。

取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解, 并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

三、酶活

蛋白酶酶活测定方法及原理 Protease activity assay method and principle

方法

原理

福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝

福林酚法

混合物，而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活。 考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使

考马斯亮蓝法

染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

甲醛滴定法

蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活。 用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为

DHT-酪蛋白法

底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉

蛋白酶酶切位点

蛋白酶的分类及作用位点 蛋白酶 氨基肽酶 菠萝蛋白酶 羧肽酶A 羧肽酶B 羧肽酶Y 分类 金属蛋白酶 巯基蛋白酶 锌金属蛋白酶 锌金属蛋白酶 丝氨酸羧肽酶 作用位点 已知抑制物 带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；2，2，双吡啶，1．1()-菲咯啉 不分解由X-Pro、D或Q组成的肽键 无特异性 α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化 带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端；EDTA，EGTA 不能分解R、P或羟脯氨酸 K- Lys，R- Arg羧基端 氨基酸羧基端 EDTA，EGTA，碱性氨基酸 PMSF 组织蛋白酶C 琉基蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 胶原酶 dispase 金属蛋白酶 金属蛋白酶 氨基端双肽，可通过K，R或P氨基醋酸碘， 甲醛 端作为第二或第三个氨基酸封闭 在F- Phe,T- Thr或Y- Tyr之后 在P-X-G-P肽链中X之后 无特异性 在R- Arg之后 在E- Glu/Gln或D- Asp之后 在K- Lys之后 在D-D-D-D-K-肽链中K之后 在R- Arg之后 无特异性 在一些R- Arg之后 抑肽酶,PMSF,TPCK,α-巨球蛋白 EDTA,EGTA,还原剂,但无血清

实验26 过氧化氢酶活力的测定（必修）

[目的与原理]

掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法，并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。

血清中的过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应，可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，即可计算出CAT的活力，CAT活力单位定义为：每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。 [试剂与器材] 试剂：

1、磷酸盐缓冲液（67mmol / l，pH=7.4）：取Na2HP04 7.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸馏水中，调pH至7.4。

2、基质液（65μmol/ l, H2O2）：取30% H2O2 3.69 ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。 3、钼酸铵：称取［(NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸馏水中。 器材：

721分光光度计 , 0.5cm比色杯，恒温水箱（37℃±0.5℃），试管 16mm×100mm，移液管，吸耳球，可调微量进样器。 [实验步骤]

1、样品测定：基质液置于37℃水浴 5 min，然后按下列步骤操作 试剂 基质液 钼酸铵 缓冲液 血清

对照管 1.0

蛋白酶酶切位点

蛋白酶的分类及作用位点 蛋白酶 氨基肽酶 菠萝蛋白酶 羧肽酶A 羧肽酶B 羧肽酶Y 分类 金属蛋白酶 巯基蛋白酶 锌金属蛋白酶 锌金属蛋白酶 丝氨酸羧肽酶 作用位点 已知抑制物 带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；2，2，双吡啶，1．1()-菲咯啉 不分解由X-Pro、D或Q组成的肽键 无特异性 α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化 带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端；EDTA，EGTA 不能分解R、P或羟脯氨酸 K- Lys，R- Arg羧基端 氨基酸羧基端 EDTA，EGTA，碱性氨基酸 PMSF 组织蛋白酶C 琉基蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 胶原酶 dispase 金属蛋白酶 金属蛋白酶 氨基端双肽，可通过K，R或P氨基醋酸碘， 甲醛 端作为第二或第三个氨基酸封闭 在F- Phe,T- Thr或Y- Tyr之后 在P-X-G-P肽链中X之后 无特异性 在R- Arg之后 在E- Glu/Gln或D- Asp之后 在K- Lys之后 在D-D-D-D-K-肽链中K之后 在R- Arg之后 无特异性 在一些R- Arg之后 抑肽酶,PMSF,TPCK,α-巨球蛋白 EDTA,EGTA,还原剂,但无血清

实验六 乳酸脱氢酶酶活力测定 及紫外吸收法测定蛋白质含量

目的要求

(1) 掌握LDH活性测定原理；

(2) 学习用比色法测定酶活性的方法。

实验原理

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。

LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为

简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位。定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。

利用上述原理，改变不同第五则可测定相应脱氢酶反应过程中A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢

温度对木瓜蛋白酶活性的影响

实验目的

1.1 掌握蛋白酶活性的测定方法

1.2 理解酶促反应的最佳温度、酶的热稳定性 1.3 了解蛋白酶的催化反应机理

2 实验原理

酶既具备一般非生物催化剂的加快反应速度的功能，又具有一般催化剂所不具备的生物大分子的特征。

酶与一般非生物催化剂相比，具有以下几个特点：

a.酶的主要成分是蛋白质。b.酶促反应所需的活化能较低。c.酶的催化效率非常高。d.酶具有高度的专一性。

影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH、温度、激活剂及抑制剂等。

木瓜蛋白酶属于中性蛋白酶，它的催化作用受温度的影响较大。在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃。另外，酶的热稳定性也是酶性质研究的重要内容。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性并无明显的改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性，但不能使酶失活。

木瓜蛋白酶是一种具有广泛底物专一性的巯基类蛋白酶。有很强的分解蛋白质的能力，此外还具有水解酰胺键和酯键的特性。由于它具有适用pH范围广，热稳定性好等优点，广泛应用于食品，工业，医药生产中。

位于木瓜蛋白酶

菠萝蛋白酶提取

一． 实验目的:

1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性； 2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。

二．实验原理：

菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。 在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。

提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。 高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。 有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。 本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是

主要介绍一些蛋白酶之类的测试方法

NY

中华人民共和国农业行业标准

NY/T1103.2－2006

转基因植物及其产品食用安全检测 抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定

Safety assessment of genetically modified plant and derived products

Part 2: assay of anti-nutrients pancreatic typsin inhibiter

2006-07-10发布 2006-10-01实施

中华人民共和国农业部 发布

主要介绍一些蛋白酶之类的测试方法

前 言

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、农业部科技发展中心、中国农业大学、天津市卫生防病中心。

本标准主要起草人：杨月欣、王竹、韩军花、李宁、汪其怀、黄昆仑、刘克明、刘培磊、连庆。

本标准首次发布。

主要介绍一些蛋白酶之类的测试方法

转基因植物及其产品食用安全检测 抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定

1 范围

本标准规定了转基因植物及其产品中胰蛋白酶抑制剂的测定方法。

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

蛋白酶产生菌的筛选

组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：***

一、实验目的

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

学习从自然界中分离蛋白酶产生菌

二、实验内容

蛋白酶产生菌的分离

三、实验原理

许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。

四、实验材料和用具

1.材料：土壤样品

2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL

无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、

3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇

床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

五、操作步骤

（一） 配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，

琼脂 1.5～