培养基配制标准操作规程

******制 药 有 限 公 司 文件名称 起 草 人： 审 核 人： 审 核 人： 批 准 人： 颁发部门 分发部门 质量部 质量部、质量保证室、质量控制室 培养基适用性检查标准操作规程 起草日期： 审核日期： 审核日期： 批准日期： 部门： 文件编号： SOP-QC-000-03 页 码 版 本 号 生效日期 1/6 03 1 目的

建立培养基适用性检查的标准操作规程，保证微生物限度检查结果的准确性和可靠性。 2 范围

适用于微生物限度检查中成品培养基、脱水培养基或按处方配制的培养基。 3 职责

质量部组织制订，微生物限度检查操作人员负责实施。 4 内容

4.1 依据：《中国药典》2015年版四部。 4.2 概述： 4.2.1

培养基质量是影响微生物限度检查结果的重要环节。计数测定用培养基的促

生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。 4.2.2

培养基适应性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生

长状态或特征来评价判断检验用培养基是否符合检验要求。

常用培养基的配制

（一）营养琼脂培养基

【用途】供细菌总数测定、保存菌种、细菌纯化、一般细菌培养、血琼脂培养基基础之用。

【成分】牛肉膏 3g

NaCl 5g 蛋白胨 10g 琼 脂 20g

【pH值】7.2±0.2

【制法】上述成分称取38g加蒸馏水1000ml，经121.3℃ 30min高压灭菌备用。 （二）蛋白胨水培养基

【用途】供细菌培养、吲哚试验之用。

【成分】蛋白胨 10g

氯化钠 5g

【pH值】7.6 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装于试管，每管2～3ml，经121.3℃ 20min高压灭菌备用。

（三）半固体培养基

【用途】供观察细菌动力、菌种保存、H抗原位相变异试验等。 【成分】蛋白胨 10g

氯化钠 5g 琼脂 2.5～3g

【pH值】7.6

【制法】上述成分加入1000ml蒸馏水中，加热溶解，分装于试管，每管3～4ml，经 121.3℃ 20min高压灭菌备用。

（四）营养肉汤培养基

【用途】供一般细菌培养、转种、复苏、增菌等，也可用于消毒效果的测定。 【成

无菌检查用培养基的适用性检查标准操作规程

目的：建立无菌检查用培养基适用性检查标准操作规程。 范围：适用于无菌检查使用培养基的适用性检查。 依据：中国药典》2015年版

《药品生产质量管理规范》2010年修订 《中国药品检验标准操作规程》2010年版 责任：QC化验员对实施本规程负责。 内容:

1、概要：无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检查要求。本检查可在供试品的检查前或与供试品的检查同时进行。 2、材料及设备 2.1 生化培养箱 2.2 生物安全柜

2.3 中国浊度标准管（由中国药品生物制品检定所提供） 2.4 灭菌试管、灭菌注射器 2.5 0.9%无菌氯化钠溶液

2.6 0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液：取聚山梨酯80 0.05ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠至100ml，混匀，灭菌即可。 3、无菌检查培养基的适用性检查 3.1无菌性检查

取新鲜配制灭菌的培养基各5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃，胰酪大豆胨液体培养基置20～25℃，培养14天，应无菌生长。 3.2灵敏度检查 3

培养基的配制及灭菌

一． 实验目的

1. 三角瓶，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒等仪器的清洗。

2. 三角瓶棉塞的制作，三角瓶，吸管，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒的包装与灭菌。

3. 高温蒸汽灭菌原理的学习。

4. LB和MacConkey培养基的制作与灭菌。

二． 实验原理

1. 高温灭菌的原理：

由于培养基配置过程中并非是无菌操作，所以要通过立即灭菌来防止配制过程中混入的杂菌利用培养基中的营养物质进行繁殖从而破坏培养基的性能。

高压蒸汽灭菌是生物试验应用最广，效果最好的一种湿热灭菌法。在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

注意：①使用高压蒸汽灭菌前一定要完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。否则在同一压力下，锅内实际温度和理想温度就会有差距，不能达到最好灭菌效果。②在使用灭菌锅前切勿忘记加水，水加至与三角搁架相平，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。③使用完后要等到压力降为零再打开锅盖，否则会因为锅内外压力不平衡而导致棉塞蹦出造成污染，也容易伤害到操作者。

2. 培养基的配置原

质量技术监督检测检验所

微生物室试剂及培养基配制记录 试剂、培养基名称 双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨 单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨 煌绿乳糖胆盐（BGLB） 乳糖胆盐（双料） 乳糖胆盐（单料） 0.85%生理盐水 BPW 志贺氏菌增菌肉汤 TTB增菌液 SC增菌液 7.5%NaCl肉汤 平板计数琼脂 BP琼脂 MAC琼脂 BS琼脂 XLD琼脂 孟加拉红琼脂 伊红美蓝琼脂 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） 1mol/L氢氧化钠 1mol/L盐酸 备注： 类型 液体 液体 液体 液体 液体 液体 液体 液体 液体 液体 液体 固体 固体 固体 固体 固体 固体 固体 固体 液体 液体 试剂称取量 g 加入蒸馏水mL 10 mL× 10 mL× 10 mL× 10 mL× 10 mL× 225 mL× 9 mL× 225 mL× / 225 mL× / 10ml× 10 mL× 225 mL× /

培养基验收规程

1 目的

规范培养基验收的过程和项目，以保证实验室所用培养基符合要求。

2 适用范围

适用于本实验室培养基的验收工作。

3 职责

培养基验收员应遵循本规程，按照本规程的要求进行培养基验收。 建立并更新《实验室在用培养基清单》

4 程序

4.1术语和定义

4.1.1培养基批量：是培养基完整的可追溯单位，是指满足产品要求（内部控制）和性能测试，产品型号和质量稳定的一定量的半成品或成品。这些产品在特定的生产周期生产，而且编号相同。

4.1.2商品化脱水合成培养基：使用前需加水和处理的干燥培养基，如：粉末、小颗粒、冻干粉等形式：

——完全培养基；

——不完全培养基，使用的时候需加入添加剂。

4.1.3商品化即用型培养基：以即用形式或融化后即用形式置于容器（例如平皿、试管或其他容器）内供应的液体、固体或半固体培养基： ——完全可即用的培养基； ——需重新融化的培养基；

——使用前需重新融化并分装的培养基；

——使用前需重新融化，添加物质并分装的培养基。

4.2培养基接货验收

培养基的接货验收，由培养基验收员完成。

新购买的商品化脱水合成培养基（通常为脱水的粉状或颗粒装）和商品化即用型培养基，应保

BG11培养基配方 成分

浓度(mg/l) 母液配制 Con. (g/l) 每升水取母液体积(ml/l) 物质称重(g) 定容(ml)

NaNO 3 1500 150 10 15 100 K 2HPO 4﹒3H 20 40 40 1 4 MgSO 4﹒7H 20 75 75 1 7.5 CaCl 2﹒2H 20 36 36 1 3.6 柠檬酸铁铵 6 6 1 0.6 柠檬酸 EDTA 1 1 1 0.1 Na 2CO 3 20 20 1 2 A5+Co

1

注：A5+Co 母液为H 3BO 3 2.86g/l ；MnCl 2﹒4H 20 1.81g/l ；ZnSO 4﹒7H 20 0.222g/l ；CuSO 4﹒5H 20 0.079g/l ；NaMoO 4﹒2H 20 0.390g/l ；Co(NO 3)2﹒6H 20 0.0494g/l

大肠杆菌培养

一、菌种冻存液的制备

含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80oC冻存。 二、培养基制备

LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）

液体培养基

胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4

固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备

1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。

2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。 3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）

备注：培养基和激素母液配制方法

（1）母液配制时，先向容量瓶中注入1/3定容体积的蒸馏水，再一一称取各种盐放入烧杯中溶解，装入容量瓶，

不得一次称取所有盐，混合溶解！在配制大量母液时，氯化钙最后加入。

（2）200×Fe盐溶液

称取1.39g FeSO4?7H2O溶于水（A液）；称取1.865 g Na2?EDTA溶于热水（B液）； 将A液缓慢倒入正在加热的B液中，加水接近250ml，煮沸，混合液颜色变深，冷却到室温，定容到250ml后,置于棕色试剂瓶内4℃保存。

（3）0.5mg/ml 2,4-D母液的配法

称取50mg 2,4-D，置于小烧杯内；加少量无水乙醇或95%乙醇使之完全溶解； 加水定容至100ml，4℃保存。如果出现沉淀，需要重新配置。

（4）0.5mg/ml α-NAA母液的配法

称取100mgNAA置于小烧杯内；用1N的KOH溶液溶解NAA； 用水定容至200ml，4℃保存。

（5）0.5mg/ml 6-BA母液的配法

称取100mg 6-BA置于小烧杯中；加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少

量浓盐酸，使之完全溶解；用水稀释并定容至200ml，4℃保存。

（6）100mM乙酰丁香酮（As）

实验四一、实验目的

培养基的制备与灭菌

1、了解培养基的配制原理，掌握制备培养基的过程。

2.掌握高压蒸汽灭菌及干热灭菌的方法及注意事项

二、实验原理： 培养基是用人工方法，将多种 物质按微生物生长所需而调制成的一种营养基 质，用来分离和培养微生物。培养基可分为天 然培养基、合成培养基和半合成培养基三类。 根据是否含有凝固剂又可分为液体培养基、固 体培养基(1.8-2.0%)、半固体培养基(0.30.5%),

凝固剂一般是琼脂(洋菜),也有用硅胶与明 胶。一般来说，培养基包括有水份、碳源、 氮源、无机盐类以及生长因素等五大类营养 成份。此外还得有适宜的pH值，一定的渗透 压(即浓度)以及氧化还原电位等。 三、实验材料：三角瓶、试管、烧杯、分装 器、玻棒、天平、药匙、pH试纸，搪瓷杯、 量筒、纱布、棉花、橡皮筋、牛皮纸、角匙、 称量纸、各种生化试剂等 。

1、葡萄糖发酵培养基 蛋白胨 10g NaCl 5g 葡萄糖 10g 水1000mL 1.6%溴甲酚 紫水 pH 7.4-7.6 将蛋白胨、NaCl、葡萄糖加入水中，加热调pH至7.4-7.6, 加入1.6%溴甲酚紫水溶液。分装试管内倒置一杜氏小管， 塞上硅胶塞，灭菌。 2、乳糖发酵培养基 蛋白胨 20g