微生物痰液留取方法正确的是

关于痰液细菌学检验的标准化操作程序

1前言

众所周知，传统习惯程序的痰标本细菌学检验其临床符合率并不高,其原因是多方面的。除了痰标本采集不规范导致的不合格标本带来的培养结果与病人感染不相符外，还因为微生物和人体的相关性本身就具有复杂性：源自细菌的致病与条件致病的辨证性，如致病菌可能为正常携带，而细菌在肺通气功能异常病人的下呼吸道的可以发生单纯定植或感染，要证明培养结果与感染的相关性是医学微生物学所面临的难题，这也使得一直以来在对于痰培养的标准化进展十分缓慢，以至在各版《全国临床检验操作规程》上也未提出相应详细可行的令全国同行公认的统一规范的标准化操作程序（SOP）和完整的痰液培养的质量控制办法。习惯程序的痰标本细菌学检验的缓慢也很不适应临床诊断治疗的迫切性[1]。故而，建立规范而快速的痰液细菌学检验的SOP对于提高呼吸系统感染病的诊治水平和控制抗生素的滥用等问题均有重要的作用

痰培养阳性率普遍教低，临床符合率差的关键因素是痰标本采集不规范，不合格痰标本将直接导致病原菌被分离的机会降低，大量正常菌群也会抑制病原菌的生长或干扰病原菌的检出，降低了临床符合率；再有就是操作程序的不规范，不重视直接涂片，检验过程控制的

临床微生物标本的采集与运送

临床检验中心

贺锐

临床细菌学检验流程标 本

涂 片 培 鉴 养 定

药敏试验

发 报 告

细菌鉴定 形态学检查 生物化学检查法

如 何 免疫学检查法 认 识 细 分子生物学检查法 菌？ 生物学检查法

细菌分类 涂片镜检

临床标本的规范采集与处理 是细菌学检验标准化的开始

标本采集原则 发现感染及时采集微生物标本作病原学 检查 采集的时间应在疾病早期、急性期和症 状典型时，尽量在抗菌药物使用前采集 标本 标本采集时应严格执行无菌操作，必须 从实际感染部位得到临床标本，减少或 避免机体正常菌群及其他杂菌污染 必须取得足够量的标本，以满足培养的 要求

标本采集原则 标本采集后立即送检，床旁接种可提高病 原菌检出率 盛标本的容器须用商品无菌盒或经灭菌处 理，但不得使用消毒剂 送检标本必须注明姓名、年龄、性别、取 材部位、临床诊断和检验项目，以便实验 室能正确选用相应的培养基和适宜的培养 环境，必要时应注明选用何种抗菌药物

血液细菌培养(血培养)血培养的范围(美国CUMITECH规定)

病人体温： ≥38℃ ≤36℃ WBC计数： ≥10000 ≤1000以上四条任意一条符合，送血培养标本

血培养的范围(国内) 不

临床微生物标本的采集与运送

临床检验中心

贺锐

临床细菌学检验流程标 本

涂 片 培 鉴 养 定

药敏试验

发 报 告

细菌鉴定 形态学检查 生物化学检查法

如 何 免疫学检查法 认 识 细 分子生物学检查法 菌？ 生物学检查法

细菌分类 涂片镜检

临床标本的规范采集与处理 是细菌学检验标准化的开始

标本采集原则 发现感染及时采集微生物标本作病原学 检查 采集的时间应在疾病早期、急性期和症 状典型时，尽量在抗菌药物使用前采集 标本 标本采集时应严格执行无菌操作，必须 从实际感染部位得到临床标本，减少或 避免机体正常菌群及其他杂菌污染 必须取得足够量的标本，以满足培养的 要求

标本采集原则 标本采集后立即送检，床旁接种可提高病 原菌检出率 盛标本的容器须用商品无菌盒或经灭菌处 理，但不得使用消毒剂 送检标本必须注明姓名、年龄、性别、取 材部位、临床诊断和检验项目，以便实验 室能正确选用相应的培养基和适宜的培养 环境，必要时应注明选用何种抗菌药物

血液细菌培养(血培养)血培养的范围(美国CUMITECH规定)

病人体温： ≥38℃ ≤36℃ WBC计数： ≥10000 ≤1000以上四条任意一条符合，送血培养标本

血培养的范围(国内) 不

1. 化妆品微生物检测样品的处理（摘至GB7918） 样品的采集

1.1

所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。包装量小于20g的样品，采样时可适当增加样品包装数量。

1.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不

得打开，防止样品被污染。

1.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不

能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。

1.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取

出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。

1.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污

染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。

供检样品的制备

2.1 液体样品

2.1.1 水溶性的液体样品，可量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，混匀后，

制成1：10检液。

2.1.2 油性液体样品，取样品10g，先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL 灭

菌的吐温80，在40℃～44℃水浴中振荡混合10

土壤微生物测定

土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。

测定指标：

1、土壤微生物量 (Mierobia lBiomass，MB)

能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。

目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。

此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。

熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取

将熏蒸土壤无损地转移到20

环境中微生物的检测

微生物体积小、重量轻，因此可以到处传播以致达到“无孔不入”的地步。微生物种类繁多，对外界环境的适应能力又很强，只要生活条件合适，它们就可以迅速繁殖起来。因此，它们是自然界分布最广的一群生物。无论是南极、北极、高山、海洋、陆地、淡水，还是土壤、空气、动植物体内外，几乎到处都有它们的踪迹。

空气、水是维持人类生命不可或缺的物质。它们直接进入人体或与人接触。如果带有病原微生物，将成为传染疾病的媒介。通过空气和水中微生物的检验，对环境质量进行控制。

1.1 土壤中的微生物

1.1.1 土壤是微生物生活的良好环境

在自然界，土壤是微生物生活的良好环境。因为土壤具有微生物生长繁殖所必需的各种环境条件。 1.1.1.1 营养

土壤中有大量动植物残体、植物根系的分泌物、人和动物的排泄物，这些有机物为微生物提供了良好的碳源、氮源和能源；土壤中丰富的矿质元素可以满足微生物对矿质营养的要求。 1.1.1.2 水分和渗透压

土壤中具有一定的持水性，可为微生物提供水分；土壤的渗透压对微生物是等渗或低渗环境，有利于微生物摄取营养。 1.1.1.3 空气

土壤团粒结构中的小孔隙充满空气，土壤中氧的含量比大气少，平均为土壤空气体积的7%-8%。通气良好的

微生物限度/无菌方法学验证流程

1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月

单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有

的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐，

2. 每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天

药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏

1大肠埃希菌 2金黄色葡萄球菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5铜绿假单胞菌 6沙门菌

（细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间） 7白色念珠菌 8黑曲霉菌

（霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间）

3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天

实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证 每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用

药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。

恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证：

1. 回收率验证：回收率验证实验共需要26天

（若回收率达不

微生物限度/无菌方法学验证流程

1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月

单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有

的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐，

2. 每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天

药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏

1大肠埃希菌 2金黄色葡萄球菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5铜绿假单胞菌 6沙门菌

（细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间） 7白色念珠菌 8黑曲霉菌

（霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间）

3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天

实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证 每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用

药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。

恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证：

1. 回收率验证：回收率验证实验共需要26天

（若回收率达不

微生物学假期综合教学实习

实习时间： 2013年 6 月 25 日 开始

实习班级： 应技1101-1102 人

生命科学技术学院微生物教研室

微生物教学实习基本实验流程

第 配制牛肉膏固体培养基、3倍和单倍乳糖发酵液， 一准备无菌水及各种器皿、器材 天

）

灭菌

采集样品

（

第按要求做10倍梯度稀释

二

天

）配制伊红美测样品的细菌总数： 乳糖培养基初发酵试验：

样品的稀释液涂布按实验要求将稀释液接入兰固体和E.C液 牛肉膏平板 3倍、单倍乳糖发酵培养液 体培养基

37OC培养 37OC培养 灭菌

数平板上菌落看乳酸发酵 倒伊红美兰平板 （数，计算样品的细结果，查MPN表 第菌总数 三 检验乳酸发酵管中产酸产气的样品天 ）

伊红美兰平板划线 接E.C管

37OC培养 44.5OC培养

（挑有金属光泽、看结果，鉴定是 第

无光泽的菌落 否有粪大肠杆菌 四

天接单倍乳糖发酵管 革兰氏染色 ）

37OC培养

看复发酵结果 （ 第 综合本实验的六项结果（细菌总数、乳糖管初发酵（MPN）、伊红美兰平板鉴定、 五E.C平板鉴定、革兰氏染色、乳糖复发酵），写出实验报告 天清洗器材，并做好室内清洁。 ） （

微生物学综合教学实习

学习目

第四章 病毒

1 病毒具有哪些特点？病毒壳体有哪几种对称类型？

答：①体积微小 ②无完整的细胞结构，主要成分是核酸跟蛋白质 ③严格活细胞内寄生 ④对干扰素敏感，对抗生素不敏感 ⑤繁殖方式是复制，且具有感染性；有螺旋对称型、二十面体对称型、复合对称型。

2 什么是病毒的一步生长曲线？包括几个期？各有何特点？

答：主要以烈性噬菌体为例，一步生长曲线是定量描述烈性噬菌体生长规律的曲线，反映了每种噬菌体的三个重要的特征参数：潜伏期、裂解期的长短及裂解量。包括潜伏期、裂解期和平稳期，潜伏期细胞正处于复制噬菌体核酸和合成蛋白质衣壳的阶段，裂解期宿主菌迅速裂解、溶液中噬菌体颗粒急速增加的阶段，平稳期宿主细胞已经全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高峰的时期。

3 以噬菌体为例，说明病毒的增殖过程。

答：①吸附和侵入：噬菌体感染细菌时，其尾部为吸附器官，能识别宿主菌表面的特殊受体，然后分泌酶类溶解细胞壁，使细胞壁出现小孔，讲头部的核酸注入宿主菌内，蛋白质外壳留在宿主菌细胞外；②生物合成：进入宿主菌内的噬菌体核酸，首先转录翻译产生早期蛋白，进行晚期转录并复制子代核酸，再转录产生噬菌体的结构蛋白，子代核酸和蛋白质按一定程序装配成完整的子代噬菌体颗粒；③当宿主菌细胞