质粒与载体构建ppt

质粒与载体

点击次数：442 发表于：2008-07-08 17:32　转载请注明来自丁香园
来源：互联网


一、质粒

绝大多数的生物都是以DNA 的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication，或译为复制起点)，使整个基因体得以复制。含有复制原的遗传物质称为replicon，我们姑且把它译为为复制体吧！原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。其中质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼DNA 构成，并以超卷曲的形式存在。它们的基因体约由2,000至150,000个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如Borrelia burgdorfferi)。事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。在自然环境中它们相当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌(Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌(Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。以下我们谈的以细菌性质粒为主，

基因序列分析：

同源比对（保守性） 不同蛋白比对相似序列 预测结构域 记录：

1） 保存预测结果（同源性、二级结构）

2） 记下mapping片段（mapping时以亲水端开头，考虑溶解性），相关性质（分子量、等

电点、碱性残基数（R250）、W+Y数目、摩尔吸光系数）

3） 确定载体（原核：His-tag/Trx-tag/MBP-tag；真核：GFP-tag/Cherry-tag/Flag-tag）

网站：

NCBI CDS（mRNA编码区) Expasy 软件： Jalview

1） sequence alignment：

a、用目的基因序列进行BLAST（NCBI），比较不同物种间（哺乳、两栖、低等……）该基因的保守性（xp,np来源较可靠）。（或直接基因名+物种名进行搜索）； Main:

human/Homo sapiens

chimpanzee/Pan troglodytes monkey/Macaca mulatta dog/

horse/Equus caballus cattle/Bos taurus pig/ Sus scrofa

mouse/Mus musculus Rat/Rattus norvegi

一、目的基因的a(4.2k) PCR

1、PCR体系（引物ath-a-4.2k-F ath-a-4.2k-R 酶 fusion聚合酶 体积单位 μ l） DNA fusion 5*fusionHF 2.5mM F R ddH2O Buffer dNTP 2 *3 0.25 0.75 4 12 2 6 0.5 1.5 0.5 1.5 10.75 32.75 totle 20 60 98°C 30s 98°C 15s 56°C 30s 72°C 4min30s 72°C10min 16°C∝ 30cycle

（注：聚合酶说明：fusion聚合酶是高保真聚合酶，扩增片段为平末端） 2、跑胶

1％琼脂糖凝胶胶跑20min，观察实验结果。 3、胶回收（试剂盒回收） （1）、在紫外光下将扩增条带用刀切下，要尽量快（紫外会诱导基因突变）放在1.5mL的离心管中；（注意：刀头尽量伸进离心管内部，防止污染离心管外部可接触部位） （2）、在离心管中加入300-400μ l的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C水浴锅加热溶解直至透明； （3）、加0.5倍Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。 （4）、吸取步骤3

基因克隆的质粒载体

在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。

①F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

③Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

第一节 质粒的一般生物学特性

一、质粒DNA

细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。

1

质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：

1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），

关于表达载体的构建

1. 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类

载体既有复制子，更要有强启动子； 2. 大肠杆菌中的表达载体应含有 （1）强启动子

（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。

（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。

我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。

3. 载体构建的步骤 （1）.设计引物

1.引物的长度 用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。 2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

3. Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则

载体构建 目的基因克隆引物设计PCR质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养挑菌并菌液PCR上述菌液PCR有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用）

取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）

依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）

反应所需试剂 体积（单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液

载体构建 目的基因克隆引物设计PCR质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养挑菌并菌液PCR上述菌液PCR有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用）

取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）

依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）

反应所需试剂 体积（单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

实验目的：

1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核

酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA

分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。

5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大

小。

7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：

外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

摘要

本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。所用的酶有Hind Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。由于Hind Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。

关键字 酶切 连接 转化 重组子琼脂糖凝胶电泳

引言

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。本实验的供体是λ DNA，受体是E.coliDH5α,载体是PUC19。

DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而

真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段

（4） P/E 启动子/增强子

（5）Terms 终止信号

（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

1 / 1文档可自由编辑

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位