T细胞受体基因重排克隆性检测

基因程原工理纲要第一 第二讲讲基 因程工论属实 基概因工的程主技要术第三讲第四讲

因基工的程酶学础基因克基的隆体载与受体第五讲第六讲

目基的因克隆与分的离隆克基因检的测鉴定与第七讲第八讲克隆因基的表达与物产纯基化表达因调控的

六第

讲隆基因克的检测鉴与定载体型表选法择根据入基因插表型的选择D A电泳检N测 核法杂酸交测法 检免疫学化检法 转测筛选法

译

一节第载体表 型择法选、一药性抗标及其插入记失选择法活1. 理：pB原3R22粒上有质个两菌抗抗性素因: Te基t和rAmpr Tet。上有插入位r点amHB I和Sa Il; mpr上有插入位AP点s t。I

pR3B22

2. pR322B菌抗标记选择素(1)四素环： 抑制细生长，菌不但死细菌。杀

(2氨)青苄素抗性基因霉：生 产-内胺酰，使酶氨苄霉素转青为变青霉酮 酸，使碘青-素霉指示(液2I-I-KampiAclilin (蓝灰色)褪色。)(3环丝氨)酸杀死：长生细菌的但不杀，停止死生的细长菌。

3.

选择程：过(1四环素抗性)插入失 活如在Tet果r上插外源入DA,导N致四环 素性基因抗活，失用四环素加环可氨酸平 板丝培基养选重组择隆克。 Ttr失活的e生长菌被四素抑环，制不被丝环氨酸杀死， 留下保；

ＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｆｏｒＭａｓｔｅｒ’ＳＤｅｇｒｅｅｏｆＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｌｏｎｉｎｇｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ５－?ＨＴＩＡＢｍｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｓｉｌｋｗｏｒｍ，ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＭａｊｏｒ，弋ＵｅｎｅｔｌＣＳＪ。ＦｉｅｌｄＡｎｉｍａｌｇｅｎｅｔｉｃｓ—ＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒＰｉｎｇＣｈｅｎＰｒｏｆｅｓｓｏｒＣａｎｄｉｄａｔｅＬｉＨａｉ—ｙｉｎＣｈｏｎｇｑｉｎｇ，ＣｈｉｎａＭａｙ，２０１４删㈣㈣㈣Ｙ２５７芝葺芝葺‘独创性声明学位论文题目：塞蚕５：Ｈ！受佳基国的直隆鉴定区５：Ｈ！！缱堡受佳功能的初生研究本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者痞渗匆易签字日期：Ⅵ７％年梦月矽日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院

ＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｆｏｒＭａｓｔｅｒ’ＳＤｅｇｒｅｅｏｆＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｌｏｎｉｎｇｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ５－?ＨＴＩＡＢｍｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｓｉｌｋｗｏｒｍ，ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＭａｊｏｒ，弋ＵｅｎｅｔｌＣＳＪ。ＦｉｅｌｄＡｎｉｍａｌｇｅｎｅｔｉｃｓ—ＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒＰｉｎｇＣｈｅｎＰｒｏｆｅｓｓｏｒＣａｎｄｉｄａｔｅＬｉＨａｉ—ｙｉｎＣｈｏｎｇｑｉｎｇ，ＣｈｉｎａＭａｙ，２０１４删㈣㈣㈣Ｙ２５７芝葺芝葺‘独创性声明学位论文题目：塞蚕５：Ｈ！受佳基国的直隆鉴定区５：Ｈ！！缱堡受佳功能的初生研究本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者痞渗匆易签字日期：Ⅵ７％年梦月矽日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院

目的：探讨并发胸腺疾病的重症肌无力患者的外周血和胸腺中调节性T细胞变化。方法：采用流式细胞仪多参数(三标CD4、CD25和Foxp3)逐层分析法分析并发胸腺疾病的重症肌无力患者的外周血和胸腺中调节性T细胞比例。结果：正常人、MG并胸腺增生者和MG并胸腺瘤者外周血中CD4+阳性细胞中调节性T细胞比例差别无统计学意义(F=0.095,P=0.910),胸腺中CD4+阳性细胞中调节性T细胞比例差

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中国卫生检验杂志 2 0 0 7年 5月第 1 7卷第 5期

C ieeJunl f e t a oa r eh o g, y20 V l 7 N hns ora a hL brt yT cnl y Ma 0 7; o 1 o oH l o o 5

83 7

【临床检验】

流式胞术检测细重症肌患者调节细胞变 无力性T化周向京(广东省深圳市第二人民医院检验科，广东深圳 5 83 ) 10 5

[要]目的：摘 探讨并发胸腺疾病的重症肌无力患者的外周血和胸腺中调节性 T细胞变化。方法：采用流式细胞仪多参数(三标 CM、D 5和 F x3逐层分析法分析并发胸腺疾病的重症肌无力患者的外周血和胸腺中调节性 T细胞比例。

细胞克隆形成实验

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：

一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。

实验方法：

平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验

(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞

(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。

平板克隆形成实验基本步骤：

1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀

细胞克隆形成实验

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：

一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。

实验方法：

平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验

(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞

(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。

平板克隆形成实验基本步骤：

1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀

基因克隆的质粒载体

在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。

①F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

③Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

第一节 质粒的一般生物学特性

一、质粒DNA

细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。

1

质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：

1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），

整个基因克隆实验规程

完整

Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】

一、组织总RNA 的提取

相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水

相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、

100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。

相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。

实验步骤

1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅

速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。

2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；

3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；

4.4℃，,12000g 离心15min；

此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；

5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等

体积的异丙醇，轻轻混匀；

6.室温放置10

拟南芥基因的图位克隆技术

拟南芥基因的图位克隆技术

浙江大学生命科学学院 徐冰

浙江杭州 310029

1 国内外研究现状

拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。

从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。

图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等， 2002）

图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（po

KKME---专业医学搜索引擎abedc2c6e518964bcf847c9e/

Grp78基因转染肝细胞癌SMMC-7721克隆筛选及鉴

定

作者：谷燕娇, 高志安，苏荣健作者单位：1.辽宁医学院附属第一医院病理科;2.辽宁医学院科学实验中心，辽宁锦州

【摘要】目的用Grp78基因转染人肝细胞癌SMMC-7721，筛选阳性克隆并鉴定。方法利用真核表达载体pcDNA3.1+Grp78转染SMMC-7721，pcDNA3.1+Grp78与转染试剂的比例(Μg/ΜL)分别为2∶3、2∶4、2∶5、2∶6、2∶7、2∶8、2∶9，400 Μg/mL G418筛选阳性克隆后，传代扩增，Western Blot鉴定克隆的Grp78表达情况。应用pcDNA3.1空载体作为阴性对照。结果Western Blot显示，转染后的SMMC-7721经G418筛选，除一个克隆不高表达外，其余克隆均高表达Grp78。结论Grp78转染SMMC-7721的最佳转染效率是8∶2(转染试剂/DNA)，由于假阳性克隆的存在，筛选后的克隆需要鉴定。

【关键词】Grp78;基因转染;克隆筛选

Selecting and Verifying SMMC-7721 Clones Transfec