乳酸细菌分类鉴定及实验方法

细菌分类鉴定规程

细菌分类鉴定规程

杜艳、余翔、罗国升

新菌鉴定主要流程：

1、 潜在新菌的确定

拿到拼接好的16Sr RNA gene序列后，进入NCBI blastN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或EzTaxon server 2.1 (http://147.47.212.35:8080/) 进行比较，同源性低于98%的序列(同源性处于98-97%之间的序列最好少于3株)，可初步判断存在新菌的可能。

2、 选择标准菌株构建进化树

选择参考菌株构建三种进化树 (NJ、MP和ML)，构建进化树是需要注意以下几点：1）所选择的序列必须都是在IJSEM上正式发表的序列，2）所选择的参考菌株必须包含新菌所在属的所有标准菌株，3）需要选择新菌所在科的一些与新种所在属相近的属的type species作为参考菌株，4）需要选择一个远源的菌株作为参考菌株，如：E. coli。 3、 购买标准菌株

根据进化树位置和同源性高低选择标准菌株作为参考菌株，联系相关保藏机构购买标准菌株。具体信息可以在http://www.bacterio.cict.fr/ 上查找。

标准菌株的选择需遵循以下几点：1) 如果要用到不同的属但不是用这些

细菌分类鉴定规程

细菌分类鉴定规程

杜艳、余翔、罗国升

新菌鉴定主要流程：

1、 潜在新菌的确定

拿到拼接好的16Sr RNA gene序列后，进入NCBI blastN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或EzTaxon server 2.1 (http://147.47.212.35:8080/) 进行比较，同源性低于98%的序列(同源性处于98-97%之间的序列最好少于3株)，可初步判断存在新菌的可能。

2、 选择标准菌株构建进化树

选择参考菌株构建三种进化树 (NJ、MP和ML)，构建进化树是需要注意以下几点：1）所选择的序列必须都是在IJSEM上正式发表的序列，2）所选择的参考菌株必须包含新菌所在属的所有标准菌株，3）需要选择新菌所在科的一些与新种所在属相近的属的type species作为参考菌株，4）需要选择一个远源的菌株作为参考菌株，如：E. coli。 3、 购买标准菌株

根据进化树位置和同源性高低选择标准菌株作为参考菌株，联系相关保藏机构购买标准菌株。具体信息可以在http://www.bacterio.cict.fr/ 上查找。

标准菌株的选择需遵循以下几点：1) 如果要用到不同的属但不是用这些

摘要:药敏试验能够快速的确定病原菌以及药物敏感结果，加强耐药监测，减少用药的盲目性，合理使用抗生素有效控制感染，避免耐药菌的产生，提升治愈率。临床微生物实验室应选择先进、方便的方法进行常规的抗菌药物敏感实验。

关键词:临床,常用,细菌,药敏,试验,方法，药敏,试验,能够,快速

药敏试验能够快速的确定病原菌以及药物敏感结果，加强耐药监测，减少用药的盲目性，合理使用抗生素有效控制感染，避免耐药菌的产生，提升治愈率。临床微生物实验室应选择先进、方便的方法进行常规的抗菌药物敏感实验。

一、国内常用常用的四种方法:

第一种纸片扩散法

原理:将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，在纸片周围抑菌浓度范围内测定菌的生长被抑制，从而形成无菌生长K的透明圈即抑菌圈。其大小反映测试菌对测定药物的敏感性，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度呈负相关。

优点:药敏试验具有重复性好、操作简便、试验成本相对较低、结果直观、容易判读、便于基层开展等。

缺点:其虽是一一种传统、经典的药敏试验方法，但随着全自动微生物分析仪的推广和应用，K-B 纸片扩散法出现药敏试验假耐药、受人为因素影响较大、试验耗时长的缺点也渐渐体现出来，同时快速性、准确性方面存在不足[1]。

应用:应用于兼性厌氧

细菌分离培养方法及操作步骤

无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基，37℃恒温培养24 h，观察其生长特性。目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法和实验动物分离法。

平板划线接种法

这是目前临床上最常用的分离接种方法。它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落（有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌），以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。具体操作：

1、右手持接种环，在酒精灯上火焰灭菌；

图1 病料采集 图2 接种环灭菌

2、待接种环冷却后，挑取被检料少许，左手持琼脂平板，以食

指为支点，用拇指和无名指将平皿揭开一空隙。大约20℃时，迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。

3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。（注意：划线时，以腕力使接种环在琼脂平板表面划动，尽量不要划破培养基，划的线条要密，但不能重复旧线，以免培养物形成菌苔。）

图3 平板划线接种法

4、划线完毕，合上平皿盖，将琼脂平板倒置，放入37℃温箱内培养18－24小时。

注意：分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样表面即干

Western blot 实验

1、试剂配制： （一）母液

1.0mol/L Tris·HCl

Tris (MW121.14) 12.12g 蒸馏水 50ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8（见下所示），最后用蒸馏水定容至100ml，室温下保存。 注：PH ： 6.8 约需22ml浓盐酸

10％ SDS

SDS 10g

蒸馏水定容至 100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周，最好现配先用。

1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris 18.2g

蒸馏水 50ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用蒸馏水定容至100ml，室温下保存。

30％Acr/Bic（29：1

MTT原理：

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570nm 处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。

MTT 溶液的配制方法：

通常，此法中的 MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

实验步骤：

（1）接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积20

细菌发酵L乳酸的研究

南开大学硕士学位论文细菌发酵L-乳酸的研究

姓名：徐子钧申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：刘如林

20030601

细菌发酵L乳酸的研究

细菌发酵Ｌ（＋）一乳酸的研究

摘婪

摘要

从自然界筛选到一株产高光学纯度Ｌ（＋）｛Ｌ酸产生菌ｓ３，经初步鉴定为乳杆菌属。经过复合诱变（Ｕ．Ｖ、ＮＴＧ、ＬｉＣｌ和ＤＥＳ），并根据对其代谢途径的分析和代谢调控理论筛选诱变菌株，最后成功地得到Ｍ７菌株，其Ｌ（＋）．乳酸产量提

高了３０％。经营养缺陷型类型鉴定，ｓ３为氨基酸和核酸碱基双缺型，Ｍ７为氨

基酸缺陷型。

利用数据统计软件ＳＡＳ系统（ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ），采用较先进的试

验设计方法二水平设计中的ＰｌａｃｋｅＲ—Ｂｕｒｍａｎ设计以及响应面分析法中的

Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ设计优化培养基，使Ｌ（＋）哥Ｌ酸产量提高ｌ５％。在优化条件下，７２ｈｒ可产Ｌ（＋）．乳酸９２～１＿ｏｏｇ／Ｌ，初步建立了动力学数学模型。

选定大孔吸附弱碱性阴离子树脂Ｄ３０１Ｇ从发酵液中提取乳酸，进而对原位分离发酵生产Ｌ（＋）．乳酸进行了初步探讨。为了解决原位分离中菌体流失的问题，对固定化细胞发酵作了初步研究。

关键词：乳酸菌，Ｌ（＋）一乳酸，复合诱变，Ｐｌａｃ

★脾细胞保存方法

（一）短期保存技术

适用范围：术后1周PRT反应。

保存方法：将分离到的细胞用适量含10％～20％灭活小牛血清的RPMI1640培养液稀释重悬。置4℃保存较好，可减低细胞代谢活动。要注意不要迅速改变细胞所处的温度，以免造成细胞“温度”休克。保存1管即可。 （二）长期冷冻保存技术

适用范围：术后2周以后的PRT反应。 保存方法：利用液氮深低温（－196℃）环境保存细胞，冷冻时的降温速度和细胞解冻时的升温速度对细胞活力的保存有很大影响。低速离心后，取沉积细胞用含10％二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管内（保存3管），速即放入降温过渡站中，避免二甲亚砜对细胞的损伤。用两步降温法，即迅速降温至－80℃低温冰箱过夜，或在液氮罐液面以上的一层空间放置片刻，然后再放入液氮中。如需复苏细胞，则需迅速解冻以恢复细胞的活力，要求在20s以内完全融化。将冻存管自液氮中取出，立即放入40℃温水中，融化后即从水中取出，吸出细胞悬液，加入10倍的培养液中混匀，继而低速离心，尽快洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力，然后置37℃培养箱内培养。

★相关试剂的配制

（一）PBS：800ml蒸馏水中，溶解8克N

实验一 准备实验（一）

分光光度计的使用

一. 目的

通过电化教学方式学习分光光度计的工作原理 掌握比色测定的基本操作方法

二. 原理

光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm：小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。

当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。

LI0CI分光光度法依据Lambert-Beer定律：lg令A = lgI0II0I = KCL

，T =

II0，则A = KCL，A = -lgT

A：吸光度（有时用光密度OD表示） I0：入射光强度 L：溶液的光径长度

其中：T：透光率 I： 透射光强度 K：吸收系数 C：溶液的浓度

从上式可以看出，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比，当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L不变时，吸光度A与溶液的浓度C成正比。

4

三. 实验材料及设备

1. 仪器

分光光度计 放相

一、土壤有机碳测定

实验方法：重铬酸钾容量法——外加热法

仪器：油浴消化装置、矿物油或植物油、可调温电炉、分析天平（感应量0.0001g）、硬质试管、温度计（0~300℃）、酸式滴定管、三角瓶（250ml）、小漏斗 试剂：0.8mol·L-1（1/6K2Cr2O7）标准溶液、浓硫酸（分析纯）、0.2mol·L-1FeSO4溶液、0.1mol·L-1（1/6K2Cr2O7）标准溶液、邻菲罗啉指示剂

二、土壤全氮量测定

实验方法：凯氏定氮法

仪器：消化炉、消化管、分析天平（感量0.0001g）、凯氏定氮仪 试剂：浓硫酸、混合催化剂、40%NaOH溶液、硼酸指示剂

三、土壤有效性氮测定

实验方法：扩散吸收法

仪器：半微量滴定管（5ml）、扩散皿

试剂：1.8mol·L-1氢氧化钠溶液（适用于旱地土壤）、1.2mol·L-1氢氧化钠溶液（适用于水稻土）、2%硼酸溶液、0.01mol·L-1盐酸溶液、特制胶水（阿拉伯胶）、硫酸亚铁（粉状）

四、土壤全磷量测定

实验方法：HClO4—H2SO4消煮法

仪器：分析天平、开氏瓶或消化管、小漏斗、电炉、三角瓶、移液管、比色杯、容量瓶、分光光度计

试剂：浓硫酸、70%~72%高氯酸、2,6-二硝基酚或2,4