过氧化氢酶的提取及米氏常数的测定

篇一：过氧化氢酶动力学常数测定

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）

1.7

2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）

(A?B)?VT?1.7FW?V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=

酶活(mgH2O2/g·min)=0.218

（A-B）=0.8 VT=20.25FW=5.032V1=2.5mlt=10min

二、动力学常数的测定 （一）原始数据

（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度

V0

（三）以1/V0对1/[S]0作图（用exc

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2

过氧化氢酶制备与测定

小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

摘要：

过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。

过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。 现报告如下：

一、实验器材

1、实验动物： 成年雄性小鼠 （河北医科大学实验动物中心提供）

2、主要器材： 托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电热恒温水箱，DY

实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 实验方案：

匀浆 制备过氧化氢酶 盐析 透析 层析 纯度及分子测定（SDS-PAGE） 过氧化氢酶测定 蛋白含量测定（lowry法） 米氏常数测定（Lineweaver-Burk）双倒数作图法 （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液

一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用 二、实验原理：

1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞

匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3、氯仿; Pr沉淀剂，CAT由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4、离心：离心机 离心力 分离固液 三、实验步骤：

1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g

2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,

组织捣碎机匀浆3-5min

3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min 4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液 5【、留样】取匀浆上清液60

实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 实验方案：

匀浆 制备过氧化氢酶 盐析 透析 层析 纯度及分子测定（SDS-PAGE） 过氧化氢酶测定 蛋白含量测定（lowry法） 米氏常数测定（Lineweaver-Burk）双倒数作图法 （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液

一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用 二、实验原理：

1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞

匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3、氯仿; Pr沉淀剂，CAT由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4、离心：离心机 离心力 分离固液 三、实验步骤：

1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g

2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,

组织捣碎机匀浆3-5min

3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min 4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液 5【、留样】取匀浆上清液60

实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 实验方案：

匀浆 制备过氧化氢酶 盐析 透析 层析 纯度及分子测定（SDS-PAGE） 过氧化氢酶测定 蛋白含量测定（lowry法） 米氏常数测定（Lineweaver-Burk）双倒数作图法 （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液

一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用 二、实验原理：

1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞

匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3、氯仿; Pr沉淀剂，CAT由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4、离心：离心机 离心力 分离固液 三、实验步骤：

1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g

2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,

组织捣碎机匀浆3-5min

3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min 4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液 5【、留样】取匀浆上清液60

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

实验七 过氧化氢含量的测定（4学时）

一、实验目的

1．掌握0.01mol.L-1KMnO4溶液的配制方法，（溶液煮沸1小时）; 2．掌握用Na2C2O4基准物质标定KMnO4的条件（温度、酸度、滴定速度）; 3．注意用KMnO4标准溶液滴定H2O2溶液时，滴定速度控制（先慢、后快、终点前慢）.

4.对自动催化反应有所了解。

二、实验原理

过氧化氢具有还原性，在酸性个质中和室温条件下能被高锰酸钾定量氧化，其反应方程式为：

2MnO4- + 5H2O2 + 6H+ = 2Mn2+ + 5O2↑+ 8H2O

室温时，开始反应缓慢，随着Mn2+的生成而加速。H2O2加热时易分解，因此，滴定时通常加入Mn2+作催化剂。

三、试剂

0.020mol/L KMnO4标准溶液；H2SO4溶液3mol/L；MnSO4溶液1mol/L；H2O2试样，市售质量分数约为30%的H2O2水溶液①。

四、实验步骤

1、0.01mol.L-1KMnO4溶液的配制与标定

配制：称取KMnO4固体约0.8克溶于250mL水中,盖上表面皿,加热至沸并保持微沸状态30S后,冷却,储存于棕色试剂瓶中.

标定：准确称取0.15-0.20克Na2C2O4基准物质3份,分别置