创业酵母

毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。

毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。

翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。

菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,

酵母双杂交相关实验方法

一、 酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法） 1、 酵母质粒提取试剂

Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol 0.1mol/L EDTA Buffer II 50mM/L Tris 20mM/L EDTA Buffer III 10mM/L Tris 1Mm/L EDTA 2、 操作步骤：

(1) 收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。. (2) 37℃水浴1h。

(3) 10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。 (4) 加入25μl 10% SDS，65℃ 水浴30min，每间隔5min中震荡一次。 (5) 加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。 (6) 4℃12000rpm离心15min，取上清。

(7) 在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。 (8) 取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。

(9) 加入150μl

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即食酵母（营养酵母）是安琪酵母公司博士后科研站运用现代生物高科技技术特别培植菌种，通过现代生物发酵技术精心培养，并由国家认证的GMP标准车间进一步加工生产的一种适宜中国人营养需要的复合营养型酵母，是新兴的、多功能的均衡营养食品，是目前国家食品药品监督管理局批准的唯一一个酵母营养保健食品。

即食酵母具有“三低四优”的特点，即低脂、低糖、低热量，不含胆固醇，含优质完全蛋白质、优质维生素、优质丰富矿物质及优质膳食纤维。所有优质营养天然配伍，浑然一体，是天然安全、高效吸收理想营养源。

丰富的优质完全蛋白质：

含完整的8种人体必需氨基酸，而且其组成的氨基酸构成比例与人体所需必需氨基酸的比例非常接近，被联合国粮农组织（FAO）认定为优质蛋白质来源。特别是中国人日常食用的谷物蛋白中含量极少的赖氨酸、苏氨酸，在酵母蛋白中含量丰富，可弥补日常饮食来源的不足，即食酵母是优化日常饮食的好搭档。

完整的天然B族维生素群：

人体所需的B族维生素都含有，而且含量比例适合人体需要，并且以磷酸脂形式存在，能充分被人体吸收和利用，可预防和改善多种B族维生素缺乏症。

丰富的人体必需矿物质：

包括铁、锌、硒、铬、锰等，且生命结合态形式存在，非常便于人体吸收利用。

丰富的优质功能性膳

pGBKT7和pGADT7不要同时转入细胞，要先转入一个，平板培养，挑单菌落做液体培养，再转入另一个质粒，同时转入两个质粒的效率太低。我做的时候转化率很高，从来没有出现过问题，转入第一个质粒（pGBKT7）通常在SD-Trp平板上可以有3000-4000个菌落，再转入pGADT7后，在双选择平板SD-Trp-Leu上至少也可以收获400-500个菌落。需要注意的是，细胞转入pGBKT7后，在-Trp上挑选单菌落做液体培养时，不要用YPD培养液，要用SD-Trp培养液，这样才可以使转化的细胞充分生长。 转化实验的条件也很重要，如果你觉得这中间有什么不放心，你可以把protocol发给我看看。我这里AH109长得很好，但实验室在国外，估计没法给你。

另外，你说AH109培养不好，是在什么选择平板上？在转完两个质粒以后做实验筛选时，应该先做LacZ和MEL1的显色，再做HIS3，最后做ADE2（因为ADE2的选择是最stringent的）。还有什么问题可以继续问我。

1.YPDA配制方法如下：

先称好Yeast Extract 和Tryptone ，各10g/L 和20g/L ， 加水885ml/L

另外称取葡萄糖20g/L，放入另一个容器内，

采用3种方法对不同酵母菌的总DNA进行提取，经琼脂糖凝胶电泳、ND-1000型微量紫外分光光度计检测以及酶切、连接、预扩增试验结果的分析，表明采用改良氯化苄法提取酵母菌的总DNA质量最好，基本无DNA碎带，蛋白质污染小。通过对野生酵母菌菌株的验证试验，进一步证明采用改良氯化苄法提取的总DNA产量稳定、重复性好，可以直接用于限制性内切酶酶切试验，完全适于AFLP分析及一些其它分子生物学研究的要求方法三：酵母菌genomics/\基因组DNA的提取

一：仪器：同方法一

二：试剂：SE缓冲液（1M山梨醇，0.1MEDTA pH7.5）；溶菌酶（蛋白酶K缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5% SDS 1mM EDTA）；其余同前

三：操作

1.5ml 对数生长期细菌细胞

离心，12000rpm,1-2min

沉淀

溶于590ulSE缓冲液中混匀+10ul溶菌酶37℃,1hr

离心，12000rpm,8-10min

沉淀

溶于100μL，0.5μl蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1hr

加入1.2ml的CTAB

毕赤酵母表达系统步骤

（参考Invitrogen公司说明书）：

一、 pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存

1 取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。 2 挑取转化子，甘油保存。 二、 载体构建

1 将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。

2 提质粒酶切鉴定或PCR鉴定 3 载体测序

测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物 三、 线性化DNA

1 提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒） 2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI 3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全； 4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）； 四、线性化DNA的去磷酸化处理 线性化质粒 43μl CIAP Buffer 5μl

CIAP酶 2μl

四、 总体积为50μl的样品37℃ 1h

酵母双杂交（筛库）

pGBK-gene 转化酵母

1. 酵母细胞（AH109）划线，YPDA平板，30°C烘箱培养18-20小时。

2. 挑取单细胞菌落，在YPDA培养基中，30°C摇床培养18-20小时至菌液饱和。

3. 次日，取饱和的酵母培养液5ml转接至100mlYPDA培养基中，30°C摇床培养2h，测

定OD600，直至OD600达到0.5左右。 4. （超净台下工作，下同）将上述菌液分装在2只50ml离心管（灭菌）中，室温下3000rpm

离心5min。

5. 弃上清，重悬于20ml无菌水中，3000rpm离心5min。

6. 弃上清，重悬于10ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。 7. 弃上清，重悬于500μl 1×TE/LiAc溶液中，室温温育10min。

8. 取eppendorf管，每管加100μl酵母细胞、5μl鲑鱼精DNA（10mg/ml，用之前沸水煮

2-3min，立即放冰上）、15μl DNA（pGBK连接的基因）。 9. 加入280μl PEG/LiAc 溶液，30°C放置45min（可摇）。 10. 42°C热激10min，立即放冰上2min。

11. 室温下6000-8000rpm离心20

酵母双杂原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型

的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧

yeast two hybrid 的protocol

介绍

试剂盒物品清单

额外附加物品列表

酵母菌株

酵母载体

方法简述：单杂交文库的构建和筛选

方法简述：双杂交文库的构建和筛选

（七） 构建用于酵母单杂交的报告质粒载体

（八） 构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体

（九） 构建生成cDNA文库

（十） 构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）

（十一） 酵母单杂交文库的构建和筛选

（十二） 酵母双杂交文库的构建和筛选

方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白

方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白

（十三） 分析阳性相互作用结果

（十四） 问题解决指南

（十五） 参考文献

（十六） 相关产品

附录A: 双链 cDNA合成的典型结果

附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法

附录C： 单杂交对照载体信息

附录D： 双杂对照载体信息 目录 （一） （二） （三） （四） （五） （六） 4 7 9 11 14 16 17 18 19 21 27 28 30 30 35 38 44 47 50 51 52 53 54 表格列表

2.9.3 β-Galactosidase 酶活定量实验

参考Clontech Yeast Protocols Handbook进行。 酵母酶活测定，

准备：每个样品，8 ml 的YPD培养基，Y190 菌株（转化用）。 Z buffer， Z buffer+beta-巯基乙醇， Z buffer+ONPG， NA2CO3

1) 准备5 ml SD/-Leu /-Trp液体培养基过夜培养的酵母菌，同时将ONPG溶解在Z缓冲液中（4 mg/ml，调pH 7.0）并振荡混匀1-2 hr；

2) 旋涡振荡器上将菌液剧烈振荡0.5-1 min，立刻取出2 ml加入8 ml的YPDA中；

3) 30℃ 250 rpm摇3-5 hr，测OD600在0.5-0.8之间并记录确切OD值； 4) 取3个1.5 ml的EP 分别倒入1.5 ml菌液，14,000 rpm离心30 sec，小心弃上清，加入1.5 ml Z缓冲液，振荡以重悬菌体；

5) 离心去上清，加入300 μl Z缓冲液重悬菌体（则浓缩倍数为1.5/0.3=5倍）； 6) 取0.1 ml至新管中，液氮冷冻0.5-1 min，37℃ 0.5-1 min使其融化； 7) 反复冻融3次以上使细胞尽可