蛋白质与酶工程

实验目录 实验一 尼龙固定化木瓜蛋白酶

实验二 β一半乳糖苷酶菌体细胞的固定化 实验三 酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定 实验四 酵母蔗糖酶活力测定及酶促动力学研究 实验五 植物体内可溶性蛋白质含量的测定 实验六 酵母蔗糖酶的结晶 实验七 酵母蔗糖酶的化学修饰 实验八 酶法澄清苹果汁加工工艺优化 实验九 原果胶酶的提取与活性测定 实验十 层析柱装填及柱效测定

实验十一温度对酶活力的影响－－最适温度的测定

实验一 尼龙固定化木瓜蛋白酶

一、原理

通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。酶的固定化方法有：吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法等。固定化酶的特性主要表现在：①稳定，不易破损，可以反复使用多次；②酶不与产品混合，制品较易纯化；③有了固定化酶，工业生产便可实现大批量、连续化、自动化。本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂

实验目录 实验一 尼龙固定化木瓜蛋白酶

实验二 β一半乳糖苷酶菌体细胞的固定化 实验三 酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定 实验四 酵母蔗糖酶活力测定及酶促动力学研究 实验五 植物体内可溶性蛋白质含量的测定 实验六 酵母蔗糖酶的结晶 实验七 酵母蔗糖酶的化学修饰 实验八 酶法澄清苹果汁加工工艺优化 实验九 原果胶酶的提取与活性测定 实验十 层析柱装填及柱效测定

实验十一温度对酶活力的影响－－最适温度的测定

实验一 尼龙固定化木瓜蛋白酶

一、原理

通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。酶的固定化方法有：吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法等。固定化酶的特性主要表现在：①稳定，不易破损，可以反复使用多次；②酶不与产品混合，制品较易纯化；③有了固定化酶，工业生产便可实现大批量、连续化、自动化。本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂

3 营养学基础知识

能量、蛋白质

能量

能量

?新陈代谢包括物质代谢和能量代谢。物质代谢又包括同化作用和异化作用。

?同化作用：生物体不断地从外界摄入营养物质，经过消化及吸收，转变成自身的成分，称为同化作用。

?异化作用：经过呼吸和氧化，把自身成分分解成二氧化碳、水及尿素，排泄到体外，称为异化作用。

?能量代谢：在同化过程中，以合成自身成分的方式将能量储存起来，在异化过程中分解自身成分释放出能量。

▲能量单位 P25

?能量单位：千卡、焦耳、千焦

?1焦耳为用1牛顿的力使1千克的物质移动1米所消耗的能量； ?1千卡指1000克纯水的温度由15℃上升到16 ℃所需的能量。 ?1千卡=4.184千焦=4184焦耳

?1千焦=0.239千卡

?能量密度：单位重量的食物所含能量的多少 ?能量密度低的食物：蔬菜

?能量密度高的食物：核桃、松子、花生、瓜子、开心果等坚果及动物油、植物油

人体能量的来源

?哪些营养素能提供能量呢？

碳水化合物、脂肪、蛋白质 人体能量的来源-碳水化合物

?人体所需能量约60%是由碳水化合物提供； ?脑组织所需能量的唯一来源也是碳水化合物；

?当血糖太低时，将使大脑活动受到严重影响，轻则反应迟钝，重则昏

班级：________________ 姓名：________________ 学号：________________ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _装_ _ _ _ _订_ _ _ _ _线_ _ _（装订线内禁止填写答案）_ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____

一、单项选择题,（在备选答案中只有一个是正确的）(本大题共100小题,100分)

1. 维系蛋白质α-螺旋和β-折叠结构稳定的化学键是

A.氢键 B.离子键 C.二硫键 D.疏水作用 E.肽键

(4)氨基酸的疏水侧链很少埋在蛋白质分子的内部 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,4

11. 在电场中，蛋白质泳动速度取决于

A.蛋白质颗粒的大小 B.蛋白质颗粒的形状 C.带净电荷的多少

D.A+C

E.蛋白质所带电荷的多少，分子量的大小

第五章 蛋白质（Protein) 本章主要内容（Content）

蛋白质的一般性质（General aspects)

■ 结构 ■ 蛋白质-水相互作用，影响蛋白质水溶性的因素 ■ 蛋白质-脂的相互作用 蛋白质的变性（Denaturation）

■ 蛋白质变性产生的效应 ■ 导致蛋白质变性的物理因素 ■ 导致蛋白质变性的化学因素

蛋白质的功能性质（Functional Properties） 定义与分类

水化性质 溶解度与粘度、凝胶作用

组织化 热凝结和形成、纤维的形成热塑挤压、面团 乳化性质 乳化能力与乳化稳定性 起泡作用 起泡性与泡沫稳定性 ?蛋白质的营养特性（Nutritional properties） ?蛋白质的开发利用（Utilization）

植物蛋白质和动物蛋白质：浓缩蛋白质与分离蛋白质利用微生物生产蛋白质——单细胞蛋白 第一节 引言（Introducti

■ 蛋白质是构成生物体的基本物质。

病毒，细菌，激素，植物和动物细胞原生 质都是以蛋白质为基

1

础的。

■ 酶是蛋白质 已经发现数以千计的酶。 ■ 蛋白质是由20种氨基酸构成的聚合物 一、蛋白质的分类： （一）根据组成分类

? 简单蛋白质（

蛋白质 (Protein)

组成（Composition）

?生物大分子（Macromolecule） ?构件分子—氨基酸 (Amino acid)

氨基酸 (Amino acids) R—基团

对氨基酸性质影响强烈

?非极性、疏水性。 ?极性、电中性。

?极性、负电荷、碱性。 ?极性、正电荷、酸性。

水溶液中的氨基酸 两性电解质

水溶液中的氨基酸 酸性氨基酸

水溶液中的氨基酸 碱性氨基酸

分类（Classification）

?非极性、疏水性的 ?极性、电中性的

?极性、带负电荷、碱性的 ?极性、带正电荷、酸性的

?植物蛋白与动物蛋白在氨基酸组成上

的差异——

?人体必须氨基酸——

8种氨基酸

?蛋白质的生物学效价（PER） ?转基因植物蛋白

?各种氨基酸配比的蛋白食品

一级结构（Primary structure）

?氨基酸——氨基+羧酸基 ?肽键(Peptide bond)

一级结构（Primary structure）

?线性结构(Linear polymer of amino

acids) ?氨基酸序列（Sequence）——蛋白质分子

?氨基末端（N-terminal） ?羧酸基末端（C-terminal）

?氨基酸残基(Amin

1- 蛋白质化学

名词解释

（一） 两性离子（dipolarion）与两性化合物 （二） 等电点(isoelectric point,pI)与等离子点 （三） 必需氨基酸（essential amino acid） （四） 稀有氨基酸(rare amino acid)

（五） 非蛋白质氨基酸(nonprotein amino acid) （六） 构型(configuration)与构象(conformation) （七） 肽键、肽平面、肽单位、多肽 （八） N末端与C末端

（九） 蛋白质的一级结构(protein primary structure) （十） 蛋白质的二级结构(protein secondary structure) （十一） 蛋白质的α－螺旋结构 （十二） 蛋白质的β－折叠结构 （十三） 结构域(domain)

（十四） 超二级结构(super-secondary structure) （十五） 蛋白质的三级结构(protein tertiary

组内公开课的课件!设计思路是最大的亮点!从干扰素的例子,设计一个个的问题,总结出蛋白质工程的流程图,从而很好的突破的蛋白质工程的原理这个重难点。

回顾： 基因工程的实质：将一种生物的 基因 转移到 另一种生物体内，后者产生它本不 能产的 蛋白质 ，进而表现 出 新的性状 。

组内公开课的课件!设计思路是最大的亮点!从干扰素的例子,设计一个个的问题,总结出蛋白质工程的流程图,从而很好的突破的蛋白质工程的原理这个重难点。

基因工程 的成果

组内公开课的课件!设计思路是最大的亮点!从干扰素的例子,设计一个个的问题,总结出蛋白质工程的流程图,从而很好的突破的蛋白质工程的原理这个重难点。

基因工程的局限性：基因工程在原则上只能生产 自然界已存在的蛋白质。 这些蛋白质的结构和功能符合 特定物种生存的需要，却不一定完 全符合人类生产和生活的需要。

组内公开课的课件!设计思路是最大的亮点!从干扰素的例子,设计一个个的问题,总结出蛋白质工程的流程图,从而很好的突破的蛋白质工程的原理这个重难点。

组内公开课的课件!设计思路是最大的亮点!从干扰素的例子,设计一个个的问题,总结出蛋白质工程的流程图,从而很好的突破的蛋白质工程的原理这个重难点。

一、蛋白质工程崛起的缘由

阅读P26第二

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用

① FRET技术（in vivo）

FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：

以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。

②酵母双、三杂交技术（in vivo）

酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。

一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两

蛋白质提取与制备 蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白