免疫共沉淀input组

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免疫共沉淀

标签:文库时间:2025-02-18
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免疫共沉淀 from WHU SKY

1用细胞刮子收细胞,3000rpm,5min,离心,去上清;或者弃培养基后直接用裂解液裂解细胞。从细胞裂解开始要保持低温,冰上或4度冰箱或4度离心机。

2 PBS清洗,重复步骤1

3选择合适的bufer裂解细胞,现加1000XAL(一般核质均分布的建议使用NP-40,核内分布的建议使用High Salt ,只要求拉下抗原的建议使用RIPA buffer),加入1ml Buffer (106-107个细胞),4℃,30min(在功能旋转仪上旋转裂解)。 4 12000rpm,15min,离心取上清(若上清仍浑浊,可重复离心1-2次)50ul上清作为 Input,其它各取400ul分别加入特异性抗体和对照IgG均1ug(可根据抗体效价酌情增减),4℃,旋转2-4h,

加抗体时要计算使用相同抗体的样品数,取(N+1~2)*1ug,用小量裂解buffer

稀释,再均分到各样品中,以保证抗体加入量的一致。 5细胞裂解液和抗体孵育期间,准备Protein G(一个反应20ul纯beads,如果beads原管中液体和beads体积比是1:1,一个样品取总体积40ul,多个样品需要多取1-2个样品的beads/液体混合物)

免疫共沉淀Co-IP步骤

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免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤

一、原理:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正

免疫共沉淀Co-IP步骤

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免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤

一、原理:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正

免疫组化

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免疫组织化学 第一节 概 述

1、概念:免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支,是应用免疫学及组织化学的原理,对组织切片中的某些化学成分进行原位显示的技术。

采用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测,检测相应的目的抗原(或抗体),并进行定位、定性和定量分析。

实际上该法是以免疫学方法取代化学方法的一种特殊的组织化学染色技术。 免疫组织化学技术的出现和发展给传统病理学带来了一场革命,使纯形态的病理学发展成为了形态与免疫信号相结合的现代病理学。其技术应用20多年来对临床病理诊断产生了深刻的影响,目前已成为了病理诊断中不可缺少的、最重要的辅助手段。 2、发展史

3、免疫组织化学的临床应用

适用于蛋白水平上组织的抗原或抗体检测。凡是组织细胞内具有抗原性的物质,如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示,因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。 主要用于常规石蜡切片难以完成的疑难肿瘤的诊断

(1)对肿瘤的组织起源进行鉴别诊断,确定转移性恶性肿瘤的原发部位 (2)对肿瘤的良恶性进行综合判断

(3)对肿瘤进行进一步的病理分

免疫组化步骤

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免疫组化步骤

1、 烤片:放于60℃烘箱内,20-25min; 2、 脱蜡:二甲苯I、II、III,3次,5min/次;

注:从烘箱中拿出迅速放入二甲苯中,防止蜡凝;

3、 复水:100%酒精---100%酒精---95%酒精---90%酒精---80%酒精

---70%酒精---50%酒精,5min/次; 4、 ddH2O洗2次,5min/次;

5、 抗原修复:柠檬酸盐抗原修复液1x(迈新MVS-0100),125℃,

5min;

注:1x修复液:198ml ddH2O + 2ml抗原修复液100x,混匀;

抗原修复高压锅的使用:确定垫圈和导热片的放入,加入700ml ddH2O,放入铁架固定切片盒,注意不要压到导热片,盖上锅盖检查排气嘴是否可以自由旋转,锅盖上的“close”对准白点,“open”所指处与边缘无缝隙,设置程序,开始;结束后等到排气口的红色指示消失即可打开锅盖;

6、 修复结束后冷却至室温(30min),1xPBS洗2次,5min/次; 7、 去除 H202酶:3%H202,15min;注意遮光;

注:用1xPBS稀释30% H202至3% H20(如5ml 30% H202+45ml 2PBS 50ml 3%H202)

免疫组化-非标记免疫酶法(PAP)

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非标记抗体酶法

由于酶标抗体存在一些缺点,例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性;②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后,与组织成分结合,可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上,发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法(Enzyme Bridge Method)和过氧化物酶抗过氧化物酶法(Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法)。现分述如下。 (一)酶桥法

1.基本原理 首先用酶免疫动物,制备效价高、特异性强的抗酶抗体,然后使用第二抗体作桥,将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上,再将酶结合在抗酶抗体,经呈色显示抗原的分布。在此过程中,任何抗体均未被酶标记,酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合,避免了共价连结对抗体和酶活性的损害,提高方法的敏感性,且能节 省第一抗体的用量。

2.染色步骤 主要程序如图4-4

图4-4 酶桥法主要染色步骤

(1)切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法,第一抗体(假设来自种属A)孵育24h(4℃)。第一抗体的稀释度可高些,使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合,较牢固,漂洗时不易丢失。

(2)切片与第二抗体(也称桥抗体,抗种属a I

免疫组化实验步骤

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石蜡切片免疫组化实验步骤

石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行(From 徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案): 1)材料的准备

在本实验室条件下推荐使用FAA(50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7% 甲醛)固定材料。

FAA固定液(100ml),室温保存 :

无水乙醇 50ml 冰醋酸 5ml 37%甲醛 10ml 水 35ml

第一天:组织固定

用FAA固定,详见“石蜡切片”protocol。 第二天:脱水

Solution 50% ethanol 60% ethanol *70% ethanol time 60 minutes 60 minutes 60 minutes number of changes one one one 以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待,并不时轻摇。 * 组织可在70% ethanol 4℃可存放几个月

第三天:进一步脱水和浸蜡

1

以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇

Solution time number of changes 85% eth

肿瘤细胞免疫组化

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临床病理工作中,我们常用到“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”,但是许多单位只写阳性结果,不写临床意义,其结果对临床帮助不大,因为许多医生不懂得这些结果的意义,因此建议大家在出此类报告时,把“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”的意义打印在报告中,以增加病理报告的使用价值。

1、恶性肿瘤免疫组化耐药预后标记,全套4项:P-gP,GSTπ,TOPOⅡ,Ki-67。

2、乳癌免疫组化耐药预后标记,全套7项:P-gp,GSTπ,TOPOⅡ,Ki-67,ER,PR,C-erbB-2。

3、意义:标记物--作用--阳性部位--临床意义

多药耐药基因蛋白(P-Gp)--药泵作用--胞膜/胞浆--阳性率越高,对下列药物耐药性越强:阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。

谷光甘肽S转移酶(GST π)--解毒作用--胞浆--阳性率越高,对下列药物耐药性越强:阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。

拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)--靶点作用--胞核--阳性率越高,对下列药物越有效:蒽环类抗生素和鬼臼毒素类,如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对VP16尤其有效。

雌激素受体(ER)--性激素作用--胞

免疫组化常用试剂

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免疫细胞化学常用试剂介绍 佚名

一、固定剂

大多数神经激素、肽类物质为水溶性,在用于免疫细胞化学研究之前,常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同,因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此,在进行免疫细胞化学研究之前,很有必要了解所要研究的物质(蛋白质或肽类)的化学性质,并根据需要来选择适宜的固定剂(或固定方法)以及改进固定条件。

目前,免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂,其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此,简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂,以供读者选用。

1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.3)

试剂:多聚甲醛 40g

0.1mol/L磷酸缓冲液 至1000ml

配制方法:称取40g多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500~800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液(Phosphate Buffer以下简称PB),加热至60℃左右,持续搅拌(或磁力搅拌)使粉末完全溶解,通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮,最后补足0.1mol/L的PB于1000ml,充分混匀。

免疫组化操作步骤

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免疫组化操作流程

试剂准备

1. PBS缓冲液(pH7.2~7.4): NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L,KH2PO4 1.4mmol/L。

2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。即抗原修复液

3.PBST: PBS+吐温-20(1000:1)洗液可全部运用PBST

4. 3% 甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

5. 封片剂:中性树脂+二甲苯。

操作流程

免疫组织化学染色

SP法:

1. 脱蜡、水化:

脱蜡前,应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟,观察石蜡应溶解。

从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟,更换二甲苯后再浸泡30分钟;

无水乙醇中浸泡3分钟;

95%乙醇中浸泡3分钟;

70%乙醇中浸泡3分钟(我用80%);

50%乙醇中浸泡3分钟;

自来水中浸泡3分钟;

梯度脱蜡

2. 抗原修复:(用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片)

高压热修复 高压锅里放少许水,用一量杯或容器(大小能容纳玻片架为宜)装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸,再放入玻片架,盖上不锈钢高压锅的盖子,将排气阀门套上,待听到阀门冒气时,即可倒计