微量肉汤稀释法原理

微量肉汤稀释法药敏检测

以下实验方法主要适用于需氧菌及部分兼性厌氧菌（以大肠杆菌为例），微需养菌和厌氧菌的培养条件亟待摸索。本实验方法，虽然操作较为繁琐，但是能够确切的得到细菌临床分离株对某种抗菌药物的MIC值，以此作为临床用药指导的部分依据。 菌悬液的制备：

① 菌液培养：取待测菌保存液10μL加入1mLMH肉汤（可根据实际需要做调整），置37℃温箱过夜静止培养12小时左右；

② OD600值测定：利用紫外分光光度仪测定OD值，MH肉汤调整菌液浓度使其OD600值落在0.08-0.1之间，此时菌液浓度约10cfu/mL（大约需将培养菌液稀释7-10倍左右）； ③ 上样菌液稀释：将待测菌液在步骤②所得稀释倍数的基础上再稀释1000倍，此时菌液浓度约10cfu/mL（即7000-10,000倍），此时的菌液即为上样菌悬液； 注意：测定OD值所需菌液应在超净台中无菌取样，剩余菌液还需实验。 抗菌药物的制备：

抗生素母液配制：参照NCCLS标准上抗菌药物相应的R（抗药）值制备待测抗菌药物（母液浓度要远远大于R值，至少160倍），分装于无菌小管置-20℃备用（附件一.常用抗生素溶液的配制）。

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注意：无菌操作，抗菌药物的稀释液均需灭菌，溶解后

微量肉汤稀释法测MIC

一、试验原理目的

细菌在96孔板MH培养基中生长，过段时间由于量大会产生白色沉淀，很容易区别有无菌落生长，将抑菌剂依次对倍稀释，加入菌悬液培养一段时间后，无沉淀的最后一个空即为MIC浓度。本试验微量样品即可测出最小抑菌浓度，且96孔板占地少，一板可做96个试验梯度，适用于大批量的检测试验，节约时间。 二、试验器材、化学试剂及菌种

96孔板、试管、5uL-50uL 微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。

菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌 三、试验准备 1、培养基的配置

MH培养基42g，蒸馏水1000ml。灭菌后待用，若一次用不完可放入4℃冰箱中放置。使用前拿出放置室温即可。 2、工器具的灭菌

将配置好的MH培养基、PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、离心管放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。96孔板在超洁净工作台上紫外杀菌30min以上。 2、抑菌剂的配置

微量肉汤稀释法测MIC

一、试验原理目的

细菌在96孔板MH培养基中生长，过段时间由于量大会产生白色沉淀，很容易区别有无菌落生长，将抑菌剂依次对倍稀释，加入菌悬液培养一段时间后，无沉淀的最后一个空即为MIC浓度。本试验微量样品即可测出最小抑菌浓度，且96孔板占地少，一板可做96个试验梯度，适用于大批量的检测试验，节约时间。 二、试验器材、化学试剂及菌种

96孔板、试管、5uL-50uL 微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。

菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌 三、试验准备 1、培养基的配置

MH培养基42g，蒸馏水1000ml。灭菌后待用，若一次用不完可放入4℃冰箱中放置。使用前拿出放置室温即可。 2、工器具的灭菌

将配置好的MH培养基、PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、离心管放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。96孔板在超洁净工作台上紫外杀菌30min以上。 2、抑菌剂的配置

稀释制冷机

He3-He4稀释制冷机原理图

1-混合器 （10mk） 2-热交换器 3-蒸馏器（0.6-0.7K）4-液池冷凝器（1K） 5-液氦预冷 6-液氮预冷 7-机械真空泵 8-液氮冷却的冷阱 9-扩散泵 10-限流器 11-真空阀

1951年H.London提出可以用超流4He稀释3He的方法制冷的理论。到1965年P.Das等人根据这一理论制成了3He-4He稀释制冷机，目前已达到2mK的低温。它可以长时间地维持毫K范围的温度，有较大的冷却能力，已成为获得毫K温度的最重要的手段和设备。

3He，4He的混合液在0.86K以上时，液3He可以以任何比例溶解在液4He中，但是当混合溶液的温度降到0.86K以下时，混合液则分离成两相，其中含3He多的相称为浓缩相，而含3He少的相称为稀释相。在低于0.86K的任一温度都对应于一定的3He含量的稀释相和浓缩相，并达到相平衡。当从稀释相中取走3He原子时，为了保持两相的平衡，则由浓缩相中的3He通过相界面进入稀释相以补充被移去的3He原子。可以计算得3He在稀释相中的焓和熵比在浓缩相中要大得多。所以这种稀释过程需要吸热，利用这个吸热现象制成了稀释制冷机。

稀释制冷机

He3-He4稀释制冷机原理图

1-混合器 （10mk） 2-热交换器 3-蒸馏器（0.6-0.7K）4-液池冷凝器（1K） 5-液氦预冷 6-液氮预冷 7-机械真空泵 8-液氮冷却的冷阱 9-扩散泵 10-限流器 11-真空阀

1951年H.London提出可以用超流4He稀释3He的方法制冷的理论。到1965年P.Das等人根据这一理论制成了3He-4He稀释制冷机，目前已达到2mK的低温。它可以长时间地维持毫K范围的温度，有较大的冷却能力，已成为获得毫K温度的最重要的手段和设备。

3He，4He的混合液在0.86K以上时，液3He可以以任何比例溶解在液4He中，但是当混合溶液的温度降到0.86K以下时，混合液则分离成两相，其中含3He多的相称为浓缩相，而含3He少的相称为稀释相。在低于0.86K的任一温度都对应于一定的3He含量的稀释相和浓缩相，并达到相平衡。当从稀释相中取走3He原子时，为了保持两相的平衡，则由浓缩相中的3He通过相界面进入稀释相以补充被移去的3He原子。可以计算得3He在稀释相中的焓和熵比在浓缩相中要大得多。所以这种稀释过程需要吸热，利用这个吸热现象制成了稀释制冷机。

电影2012是美国对中国的嘲讽

土壤全氮测定法

（半微量开氏法）

Method for the determination

of soil total nitrogen

(Semi-micro Kjeldahl method)

UDC 631.423

GB 7173－87





本标准适用于测定土壤全氮含量。

1 适用范围

样品在加速剂的参与下，用浓硫酸消煮时，各种含氮有机化合物，经过复杂的高温分解反应，转化为铵态氮。碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以酸标准溶液滴定，求出土壤全氮含量（不包括全部硝态氮）。

包括硝态和亚硝态氮的全氮测定，在样品消煮前，需先用高锰酸钾将样品中的亚硝态氮氧化为硝态氮后，再用还原铁粉使全部硝态氮还原，转化成铵态氮。

2 仪器、设备

2.1 土壤样品粉碎机；

2.2 玛瑙研钵；

2.3 土壤筛：孔径1.0mm（18目）；0.25mm（60目）；

2.4 分析天平：感量为0.0001g。

2.5 硬质并氏烧瓶：容积50ml，100ml；

2.6 半微量定氮蒸馏装置；

2.7 半微量一管：容积10ml、25ml；

2.8 锥形瓶：容积150ml；

2.9 电炉：300W变温电炉。

3 试剂

3.1 硫酸（GB 625－77）：化学纯；

3.2 硫酸

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土壤全氮测定法

（半微量开氏法）

Method for the determination

of soil total nitrogen

(Semi-micro Kjeldahl method)

UDC 631.423

GB 7173－87





本标准适用于测定土壤全氮含量。

1 适用范围

样品在加速剂的参与下，用浓硫酸消煮时，各种含氮有机化合物，经过复杂的高温分解反应，转化为铵态氮。碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以酸标准溶液滴定，求出土壤全氮含量（不包括全部硝态氮）。

包括硝态和亚硝态氮的全氮测定，在样品消煮前，需先用高锰酸钾将样品中的亚硝态氮氧化为硝态氮后，再用还原铁粉使全部硝态氮还原，转化成铵态氮。

2 仪器、设备

2.1 土壤样品粉碎机；

2.2 玛瑙研钵；

2.3 土壤筛：孔径1.0mm（18目）；0.25mm（60目）；

2.4 分析天平：感量为0.0001g。

2.5 硬质并氏烧瓶：容积50ml，100ml；

2.6 半微量定氮蒸馏装置；

2.7 半微量一管：容积10ml、25ml；

2.8 锥形瓶：容积150ml；

2.9 电炉：300W变温电炉。

3 试剂

3.1 硫酸（GB 625－77）：化学纯；

3.2 硫酸

公猪采精

猪公采精与稀释操作规程

1、采精与精液处理流程（讲究卫生，控制温度）

（1）采精过程流程

1、 进入实验室后清洁双手

2、 准备稀释液，并将稀释液放入35℃水浴锅中升温 3、 打开显微镜上的加热板控制开关，设定温度到38℃

4、 安装集精杯（预热到37℃），准备其它采精用品，放入壁厨 5、 将公猪赶入采精室，关上栅栏，清洁其体表 6、排出包皮液用0.1％KMnO4溶液清洗其腹部及包皮，再用清水洗净，抹干。 7、 戴上双层手套，诱导公猪爬跨假母猪 8、 锁定并拉出阴茎

9、 待排出部分清亮液体后，开始收集精液 10、将集精杯放入壁厨 11、将公猪赶回圈内

（2）精液处理操作流程

1．将一预温后的烧杯或塑料杯放在电子秤上，打开电子秤，当显示为零时，将装精液的食品袋从集精杯中取出放入杯中，显示读数为精液的重量。

2．将放精液的烧杯轻轻摇匀精液后，放入35℃的水浴锅中与稀释液等温。 3．立即用取样器取精液10～25微升左右，滴在载物台上预热的载玻片上，盖上盖玻片，估测活力。精子活力大于0.6，则可用于下一步的处理。

4．另取1毫升精液放入加有10毫升生理盐水的精子密度杯中，读出读数后，在查对表上查到精子密度值。

5．计算精液

微量注射泵的使用（WZ-50 C6）

WZ-50 C6型微量注射泵是一种定容型输液泵。在规定的时间内输出的药量不受输液通道内阻力的影响，当压力到达一定值时，堵塞报警系统发出报警并停机。其优点是定时精度高、流速稳定，适合用来输注硝普钠，多巴胺等急重药物。适合20ml，30ml和50ml、60ml注射器。接上后会自动识别所夹注射器的规格。

一、开机检测如没有出现Err，表示泵正常运转。

二、注射器安装；1、将抽满药液注射器连接上延长管、头皮针、排出空气；2、注射器放入注射器座中，注射器圈边必须插入注射器泵的圈边固定槽内；3、捏紧推头及摇板，移动推头至注射器推杆尾部，将注射器推片卡入推头槽中；4、当所有参数设置完毕，连续按2次快进键，第二次按住不放，待头皮针尖处药水后松手，将针头插入病人血管，再按启动键。

三、大部分设置只能在停机状态下进行，开机后数字设置键全部锁定。

四、限制量设置：按一次选择键处于设置状态；同时按静音键和选择键为复零。 五、阻塞报警阈值：按2次键,出现OCCL可设置。 六、注射器品牌选择：按3次选择键 七、快速推注；

1、输出量不计入总输出量：暂停状态下，连续二次快进。50ml注射器速率1200ml/h，30ml注射器速率600

微量注射泵的使用（WZ-50 C6）

WZ-50 C6型微量注射泵是一种定容型输液泵。在规定的时间内输出的药量不受输液通道内阻力的影响，当压力到达一定值时，堵塞报警系统发出报警并停机。其优点是定时精度高、流速稳定，适合用来输注硝普钠，多巴胺等急重药物。适合20ml，30ml和50ml、60ml注射器。接上后会自动识别所夹注射器的规格。

一、开机检测如没有出现Err，表示泵正常运转。

二、注射器安装；1、将抽满药液注射器连接上延长管、头皮针、排出空气；2、注射器放入注射器座中，注射器圈边必须插入注射器泵的圈边固定槽内；3、捏紧推头及摇板，移动推头至注射器推杆尾部，将注射器推片卡入推头槽中；4、当所有参数设置完毕，连续按2次快进键，第二次按住不放，待头皮针尖处药水后松手，将针头插入病人血管，再按启动键。

三、大部分设置只能在停机状态下进行，开机后数字设置键全部锁定。

四、限制量设置：按一次选择键处于设置状态；同时按静音键和选择键为复零。 五、阻塞报警阈值：按2次键,出现OCCL可设置。 六、注射器品牌选择：按3次选择键 七、快速推注；

1、输出量不计入总输出量：暂停状态下，连续二次快进。50ml注射器速率1200ml/h，30ml注射器速率600