重组蛋白表达系统

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH

7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH

7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8

重组蛋白纯化基本策略

捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。 精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。 分离方法的选择 根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。 分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。 处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。 速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。 回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。 在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩G

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化

（一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机

2. 方法

2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20m

中国重组蛋白药物市场报告

1、重组蛋白药物概念（不包含单克隆抗体、疫苗） 重组蛋白质是指利用 DNA 重组技术生产的蛋白质。绝大部分重组蛋白药物是人体蛋白或其突变体。主要包含细胞因子类药物、单克隆抗体、基因工程疫苗等。 重组药物的表达系统分为原核生物和真核生物表达系统。原核生物主要是大肠杆菌表达系统，真核生物表达系统主要有酵母菌、哺乳动物细胞表达系统。

目前中国上市的的重组蛋白类药物主要是大肠杆菌生产的细胞因子类药物。

美国在研药物中70%是由以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为主的哺乳动物细胞表达的。 2、中国第一个重组蛋白药物的时间、品种

1993年，我国研制成功第一个重组蛋白药物———干扰素α-1b。 3、中国重组蛋白药物的品种，主要厂家 品种

市场情况

国内主要厂家

重组人生长激素

国内5.4亿人民币

5家，深圳科兴；长春金赛，上海联合赛尔，诺和诺德；安徽安科等

G-CSF

18家，华北制药、长春金赛、北京双鹭、山东齐鲁制药、苏州中凯药业、广西北海方舟药业、上海三维生物技术有限公司等

干扰素INFα

20家，北京三元基因、深圳科兴、上海罗氏、天津华立达的安福隆、上海先灵葆雅等

胰岛素及类似物

中国23亿人民

中国重组蛋白药物市场报告

1、重组蛋白药物概念（不包含单克隆抗体、疫苗） 重组蛋白质是指利用 DNA 重组技术生产的蛋白质。绝大部分重组蛋白药物是人体蛋白或其突变体。主要包含细胞因子类药物、单克隆抗体、基因工程疫苗等。 重组药物的表达系统分为原核生物和真核生物表达系统。原核生物主要是大肠杆菌表达系统，真核生物表达系统主要有酵母菌、哺乳动物细胞表达系统。

目前中国上市的的重组蛋白类药物主要是大肠杆菌生产的细胞因子类药物。

美国在研药物中70%是由以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为主的哺乳动物细胞表达的。 2、中国第一个重组蛋白药物的时间、品种

1993年，我国研制成功第一个重组蛋白药物———干扰素α-1b。 3、中国重组蛋白药物的品种，主要厂家 品种

市场情况

国内主要厂家

重组人生长激素

国内5.4亿人民币

5家，深圳科兴；长春金赛，上海联合赛尔，诺和诺德；安徽安科等

G-CSF

18家，华北制药、长春金赛、北京双鹭、山东齐鲁制药、苏州中凯药业、广西北海方舟药业、上海三维生物技术有限公司等

干扰素INFα

20家，北京三元基因、深圳科兴、上海罗氏、天津华立达的安福隆、上海先灵葆雅等

胰岛素及类似物

中国23亿人民

第31卷 第2期2011年2月

北京理工大学学报

TransactionsofBeiinnstituteofTechnolojgIgy

Vol.31 No.2Feb.2011

GST和His标记的重组蛋白制备及

吸附纳米ZnO的研究

()北京化工大学生命科学与技术学院,北京 100029

()摘 要:以p载体为模板人工设计引物,通过P序ET-28a+)CR反应扩增带有质粒上游6聚组氨酸(6×Histidine,列的目的基因片段,克隆到原核表达载体p筛选及鉴定阳性重组子p转化E.GEX-4T-3中,GEX-HiscoliBL21细胞后通过I和6聚组氨酸标记的重组蛋白G利用NPTG诱导表达.由谷胱甘肽(GST)ST-His得到表达,iNTA系-通过蛋白结合纳米无机材料的亲和吸附实验结果证实,重组的新蛋白表现出对纳米ZnO特异吸附的生物活性.关键词:谷胱甘肽;6聚组氨酸;基因重组;蛋白表达与纯化;亲和吸附

()中图分类号:Q819 文献标志码:A 文章编号:1001-0645201102-0240-04

/统进行纯化.通过S由LDS-PAGE电泳和Westernblot分析鉴定,C-MSMS质谱分析确定所得蛋白为目标产物.

宋磊, 陈劲春

Preara

高效蛋白质表达系统1. 原核表达系统 (1)Gram negative (E. coli) (2)Gram positive (B. subtilis) 2. 真核表达系统 (1) Yeast (2) Baculovirus (3) Drosophila (4) Mammalian cells (COS, CHO, BHK etc.) 3. 其它 (1) Cell-free system (2) Protoblast

Protein Expression

Protein expression is a subcomponent of gene expression. It consists of the stages after DNA has been translated into amino acid chains, which are ultimately folded into proteins. In its simplest form, a protein expression system involves a template, a mechanism of transcription/translation such as

http://www.abbkine.com

常见蛋白表达系统的比较

在生物学研究中，重组蛋白的研究越来越受到关注，而重组蛋白最为重要的莫过于表达系统的选择。蛋白表达系统是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。常见的蛋白表达系统分为原核表达系统和真核表达系统，具体又可以细分多种，每一种有各自的优缺点。在此，小编给大家整理了各表达系统间的差异，供大家参考。

表达系统 原核生物 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 代表工程菌株 BL21-PET系统 特点 具有原核细胞良好的可操作性，成本低，产率高，但不能进行糖基化修饰，胞内分泌形成包涵体，且易产生内毒素。 产量 外源蛋白占细菌总蛋白量：胞内表达10%-70%，胞外表达0.3%-4%。 B．subtilis系细胞壁不含内毒素，很强统、B. brevis系的胞外分泌蛋白能力，蛋统 白酶易对目的蛋白降解，重组表达质粒不稳定，真核蛋白分泌量低。 酿酒酵母 兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力，但存在产量低及过度糖基化等问题。 外源蛋白占菌体总蛋白量： 10%-30%。 酵母 外源蛋白占菌体总蛋白量：约10%。 甲醇营养型 酵

1．培养基的配制

原理

http://wenku.http://www.wodefanwen.com//link?url=B2SX0TUS5KB2ovXQcKyds9MS9OnW7y5Yn204CH3vg44FsTWICJAnwePCb013a9T-vzmX5g9oCbv6GSuPahN6jfA9hVhQXCd3QCMZ_NTscu7

步骤

LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。

LB培养基的配制：

成分

胰蛋白胨(tryptone) 10g

酵母提取物(yeast extract) 5g

氯化钠(NaCl) 10g

固体培养基另加 琼脂粉 15-20g

加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min

配制方法

（1）称量 分别称取所