数字pcr原理技术及应用

微滴式数字PCR技术及市场应用

培训试题

一、填空题（2′×15）

1、Sanger法测序、ARMS-PCR和微滴式数字PCR（ddPCR）的检测灵敏度分别为： % 、 %、 %。 2、QX100微滴发生器能将每份反应液形成约 个均一的微滴，最多能同时处理 个样品。

3、QX100微滴式数字PCR检测所需样本量不能少于： ul血浆 或 ml全血， 片切片和 块绿豆大小活检组织。 4、目前QX100微滴式数字PCR技术在市场上主要应用于 拷贝数变异分析 、 稀有突变检测 、 基因表达分析 三个方面的研究。

5、在针对健康人所开展的肿瘤早期筛查项目中，ddPCR现在已经可以检测 14 种常见肿瘤中的 11 个癌基因约 60 余个突变位点。

二、选择题（3′×5）

1、微滴式数字PCR（ddPCR）的检测灵敏度为（ ）

A. 1% B. 0.1% C. 0.01% D.0.001% 2、以下哪一项不是微滴式数字PCR的技术优势（ ） A、高灵敏度、高特异性

PCR仪的原理及其操作应用 §1. PCR仪的技术原理 §2. PCR仪的分类与应用 §3. PCR仪的操作步骤轻纺与食品学院 报告人：裴乐乐 指导老师：林教授

§1.PCR原理简介PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚 合酶链式反应，主要用于DNA片段的体外 扩增，基本原理类似于DNA的天然复制过 程 ，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成。

PCR原理示意图

PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (94oC)Target Sequence

Target Sequence

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；

PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences

②模板DNA与引物的退火(复性):模

第八章 PCR技术及其应用

PCR技术的建立① Khorana(1971)等提出在体外经 DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设 想—―修复复制”但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……

②

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现

Mullis的构思引物

DNA聚合酶

DNA聚合酶

引物

特定DNA片段

94℃变性

50-65℃退火

XX℃延伸

94℃

55℃

37℃

③

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术

Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)100

酶 80 活 性 6040

(%)

20 40 50 60 70 80 90 100

温度(℃)

94℃

55℃

72℃

PCR循环

Kary B. Mullis <>1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科 学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。“我不大喜欢动手,我宁肯不动手,

PCR仪的原理及其操作应用 §1. PCR仪的技术原理 §2. PCR仪的分类与应用 §3. PCR仪的操作步骤轻纺与食品学院 报告人：裴乐乐 指导老师：林教授

§1.PCR原理简介PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚 合酶链式反应，主要用于DNA片段的体外 扩增，基本原理类似于DNA的天然复制过 程 ，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成。

PCR原理示意图

PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (94oC)Target Sequence

Target Sequence

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；

PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences

②模板DNA与引物的退火(复性):模

RT-PCR原理与实验技术

一、知识背景：

1、基因表达：DNA RNA Protein

单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白） 共合成109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。

在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：

A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。

＋

3、逆转录酶和RT-PCR

逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：

1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链

荧光定量PCR

荧光定量PCR技术 原理与结果 分析罗喜鹏

荧光定量PCR

一、含义 二、优越性 三、应用 四、定量方法 五、荧光材料 六、结果分析

荧光定量PCR

一、含义 实时荧光定量PCR技术(Real-Time

Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。

荧光定量PCR

二、优越性

特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与 传统的PCR相比，特异性大为提高。 敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml,对数期分 析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中 病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量 较为准确，标本不需稀释。 重复性 荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数 扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用， CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更 稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。 自动化 无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。

荧光定量PCR

三、应用 用于核酸的定量如RNA、DNA的定量 用于核

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数字声波测井仪原理及应用

作者：曹自力

来源：《中国化工贸易·下旬刊》2018年第06期

摘 要：声波测井作为近年来发展迅猛的一项测井方法，它是依据声学物理理论，利用声波在岩石中传播的速度来判断和识别岩体各种物理性特征。声波测井经过数十载的研究发展，现已能够从最开始的单发射单接收、单发射双接收演变到双发射双接收，在现代地质勘探领域中声波测井已经成为了一种重要的测井方式。最近几年，因为数据处理系统以及计算机的推动，利用测井实现微波分析的过程加快，从而使声波测井仪在测井勘探中得到了更多的应用，让我国的地质勘探有了进一步的发展，矿产资源也得到了更加合理的利用。本文主要分析和探讨了声波测量仪的基本原理和实际应用。 关键词：声波测井；原理；应用

在勘探地质和开发矿产资源方面，测井是一项重要技术，它不仅减少了地质勘探的工作量，而且还提高了速度，降低了成本。因为现代社会经济的不断发展，石油及其他矿产市场对资源需求量的增大，所以，对于测井仪器的技术性能更加严格需求也更大，在地质勘探领域声波测井仪的应用也变得逐渐广泛。声速和声幅测井是声波测井中最常见的，

Module 8：

定量PCR新技术新应用

2基因组-DNA 水平Genomic

Sequence

Methylation

SNPs

CNVs

转录、调控-RNA 水平Protein 水平

3荧光定量PCR 应用?绝对定量?基因表达研究?转基因食品检测?相对定量?基因在不同样本中的表达差异?药物疗效考核?阴阳性分析?病原体（HBV ，HCV ，HIV 等等）检测?禽流感检测

?等位基因分型?SNP 分析

?与疾病相关的等位基因点突变检测拓展应用?MicroRNA 分析?基因拷贝数（CNV ）分析?表观遗传学（甲基化，乙酰化）分析?蛋白质分析?肿瘤稀有突变检测?其他

4AB 的TaqMan Assays 家族

?mRNA 分析试剂盒(基因表达)：TaqMan Gene Expression Assays(超过1,000,000个预设计试剂盒，覆盖21个物种)

?miRNA 分析试剂盒：TaqMan MicroRNA Assays

?SNP 分析试剂盒(基因分型)：TaqMan SNP Genotyping Assays(超过4,500,000个人类预设计分析试剂盒)

?DME(药物代谢酶) SNP 分析试剂盒：2600个SNP 位点，分布在220个药物代谢酶基因位点上的.

PCR技术应用及注意事项威斯腾生物技术中心 TEL:400 675 6758 2014.9.1

背景

PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)是一种用于放大扩增特定的 DNA片段的分子生物学技术。

1971 Khorana 等最早提出核酸体外扩增的设想； 1983年Mullis发明并申请专利。

原理

根据DNA的半保留复制。相关酶

双链DNA

单链

DNA聚合酶 碱基互补配对

复制

两分子拷贝。

在体外实验中，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复 性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物， DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

反应体系

缓冲液 4种dNTP混合物(终浓度) 引物(终浓度) 模板DNA Taq DNA聚合酶(耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个 循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。)

Mg2+(终浓度) 双蒸水

步骤

变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR

核酸的分子杂交技术

一、核酸分子杂交

用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。

待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。

二、核酸分子杂交的分类

液相杂交

核算分子杂交 印记杂交

固相杂交

原位杂交

1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。 2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。

常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭

缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。

三、核酸分子杂交的基本原理 1、变性：

在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。

﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 ﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。

﹡变