sds电泳测蛋白的实验原理

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SDS-PAGE蛋白电泳方法

标签:文库时间:2025-02-13
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SDS-PAGE

一. 实验原理

SDS 是一种阴离子表面活性剂,在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后,巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原, SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上,形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下,SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电,使各种蛋白质的 SDS-复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量,因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明,它们在水溶液中的形状,近似于雪茄烟形的长椭圆棒,不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样,约为 1.8nm ,而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因,蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率,不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只与椭圆棒的长度有关, 也就是蛋白质 Mr 的函数。 二. 试剂器材

30%凝胶贮液(100mL):称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中,向烧杯中加入约60mL双蒸水,充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL,置于棕色瓶内4℃ 贮存,每

05实验五 SDS-PAGE蛋白质电泳准备实验

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实验五 SDS-PAGE蛋白质电泳 蛋白质电泳 准备实验----------溶液的配置 溶液的配置

实验内容

一、变性蛋白质电泳系列溶液1、单体母液 (1,4,8组) 、 50 ml 组 15.00 g 丙烯酰胺 0.40 g 甲叉双丙烯酰胺 去离子水定容至50 ml ,定性中速滤纸过滤,棕 去离子水定容至 定性中速滤纸过滤, 定性中速滤纸过滤 色试剂 瓶4℃存放。 ℃存放。 2、 10% (w/v) SDS (2,4,9组) 10ml 、 % 组 SDS 1.0 g 10 ml 去离子水

3、分离胶缓冲液(4×,pH=8.80,50 ml)( 、分离胶缓冲液( × )(1,7,8组) , )( 组 Tris-Base(1.5 mol/L) 9.08 g 10%(w/v)SDS 2 ml % 用30ml去离子水溶解,再用浓HCl调节 到8.8,过 去离子水溶解,再用浓 调节pH到 , 去离子水溶解 调节 定容到50ml,4℃存放。 滤,定容到 ℃存放。 4、浓缩胶缓冲液(4× ,pH=6.80,50 ml )( 、浓缩胶缓冲液( × )(3,5,10组) , 组 Tris-Base(0.50 mol/L) 3

SDS-PAGE电泳实验步骤

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垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

一、实验目的

学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量的多少,可制成不同孔径的两层凝胶;这样,当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大,不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时,受到的阻滞基本相同,因此以相同的速率移动;当进入小孔胶时,分子量大的蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶的界面处,样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时,在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶pH=6.7—6.8,下层胶

SDS-PAGE电泳实验步骤

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垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

一、实验目的

学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量的多少,可制成不同孔径的两层凝胶;这样,当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大,不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时,受到的阻滞基本相同,因此以相同的速率移动;当进入小孔胶时,分子量大的蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶的界面处,样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时,在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶pH=6.7—6.8,下层胶

蛋白质双向电泳实验流程

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蛋白质双向电泳实验流程

一.样品制备 1.研磨

研磨时间要尽量短,并需及时补充液氮,研磨要充分,同时要保证损失少。

2.加入8mLTris饱和酚(pH8.8)和8mL抽提液,在通风橱内研磨30s。 先加8mLTris饱和酚,Tris饱和酚会变成固体,此时需用研磨碓将固体的Tris饱和酚研磨成小块。接着加入8mL抽提液,也需将固体的抽提液研磨成小块。等三者混匀后,将粉末转移至45 mL tube。

3.振荡30min。

室温静置,待tube中固体变成液体后,开始振荡。振荡需持续30min,每振荡1min,置于冰上冷却1min。

4.10000g,4℃,10min。将酚相(top phase)转移至45mL tube。酚相(top phase)可置于冰上。

酚相应该是绿色的,水相应该是淡黄色的。

5.取6mL的抽提液和6mL饱和酚加入水相,蜗旋振荡30min。 振荡需持续30min,每振荡1min,置于冰上冷却1min。

6.10000g,4℃,10min。将酚相(top phase)转移至45mL tube。

7.沉淀酚相。取一定体积(是酚相的5倍)的0.1M乙酸铵/甲醇溶液(–20℃保存)于酚相(45mL tube)。振荡30s,

IEF-SDS PAGE双向电泳技术

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双向电泳

一、材料

样品:人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH

二、试剂

SDS-PAGE所需试剂 1、30%Acry-Bis (w/v)

29.2%Acry29.2g

0.8%Bis0.8g

加水至100ml溶解,棕色试剂瓶4℃贮存,PH<7,数月后重配

2、10%的SDS贮液 (w/v)

RT保存,因SDS在4℃会析出

3、Tris-HCl buffer

①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer

100ml含Tris18.171g,加DDW至80ml,用浓HCl调PH8.8,再定容至100ml,4℃保存

②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer:

50ml 含Tris6.057g,加DDW至40ml,用浓HCl调PH6.8,再定容至50ml,4℃保存

4、TEMED

以游离碱形式发挥作用,催化AP形成自由基,故PH较低时,聚合反应受抑制,易吸湿,被氧化,从无色变为黄色,故因密闭4℃保存

5、10% AP

1g的AP溶于10ml水中,4℃保存,隔周新鲜配置

6、PH8.3 电泳缓冲液1L,RT保存

Tris碱

Gly(25.05) SDS

加水至1L,可不调PH

7、甘油液4℃

实验六SDS-PAGE

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实验三 SDS-PAGE

【目的要求】

1.了解并掌握SDS-PAGE 电泳原理及方法。 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 【实验原理】

十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)可根据蛋白质分子大小的差别分离蛋白质,并可测定蛋白质的相对分子量,其原理主要与电泳过程中存在的特殊物理效应有关。

1 凝胶的分子筛效应:聚丙烯酰胺凝胶是在催化剂的作用下聚合而成的具有网状立体结构的微孔凝胶,蛋白质颗粒在电场中通过此凝胶时会受到阻碍。大分子蛋白质受到的阻力大,电泳速度小,而小分子蛋白质受到的阻力小,移动快,因而最终在凝胶中得以分离。 2 电荷效应:SDS 是一种表面活性剂,在蛋白样品和凝胶中加入SDS,则能与蛋白质分子上的疏水基团结合,使蛋白质表面覆盖一层SDS 分子。由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷,且电荷量远远超过蛋白质分子原有的带电量,因而掩盖了蛋白质分子本身的电荷差别,使各种SDS-蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷,分子之间的电荷差异消失。

3 变性效应:SDS 同时还破坏了蛋白质中的非共价键。导致蛋白质

变性,使SDS-蛋白质复合物在溶液中呈现相似的形状。因此蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状

11.6 生化实验报告 血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析

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血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析

【实验目的】

1、了解蛋白质分离提纯的总体思路。

2、掌握盐析法、凝胶层析法和离子交换层析的实验原理及操作技术 3、掌握电泳法分离纯化蛋白质的方法。

【实验原理】

1、蛋白质的粗提——盐析法 胶体的盐析是加盐,盐中的带电粒子使蛋白质周围的水化膜减弱,胶粒溶解度降低,形成沉淀析出的过程,是胶体的聚沉现象的一种。向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后,可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用就叫做盐析。盐析不能使蛋白质变性,可以复原。利用这个性质,可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目,亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时,离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,蛋白质溶解度更加降低,之蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同,不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同,从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫

image j对SDS-PAGE灰度分析定量蛋白浓度

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使用image j 软件对SDS-PAGE进行灰度分析,定量蛋白质的浓度。

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几种测蛋白含量方法的比较

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蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定

(一) 蛋白质测定方法的比较(原理、优缺点)

蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry法)和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry法)和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法(GB 5009.5-2010)

1.1原理 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根