rna提取试剂

提取RNA中所用各种试剂的作用：

1、氯仿：

氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA 的亲水基团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。

氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通 过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提 完之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提 掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用

通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作。 2、

异丙醇：异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受

E.Z.N.A. Total RNA Kit I (R6834-01 50 preps)

步骤

A． 真核细胞和组织

自己需要的材料：

β－巯基乙醇、70％乙醇（DEPC水配置）、除RNase的枪头和EP管。 材料的最佳量

想得到最佳的产量和好的Hibind RNA柱的纯化效果，选用正确的细胞和组织量是最重要的。Hibind RNA柱的最大处理量是可变的，根据细胞和组织的类型。最大的结合能力是100ug的RNA。TRK裂解缓冲液的最大裂解能力是1*107个细胞或30mg的组织。 细胞的步骤

1． 用500ul的TRK裂解缓冲液裂解细胞（≤1*107），使细胞团松散，轻轻弹EP管或者用

枪头吹旋，再用漩涡振荡混匀。

a) 使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β－巯基乙醇。 b) 如果是单层的组织培养细胞（成纤维细胞，内皮细胞等），可以直接在细胞培养器

里裂解细胞。完全吸去培养基后直接加TRK裂解缓冲液至细胞中。加700ul的TRK到T35细颈瓶或10cm的培养皿中，更小的培养器加500ul的TRK。将液体布满整个器皿表面，确保细胞裂解完全。将裂解产物转移至1.5mlEP管中。 c) 如果细胞是悬液培养，收集细胞（≤1,500rpm or

哺乳动物组织样品RNA的抽提

哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

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哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。 一、实验材料：

Trizol试剂（Invitrogen公司）

研钵，匀浆器，镊子，铝箔都高温灭菌即可； 二、具体过程：

1、样品在离体后应迅速冷冻在液氮中，若是比较大块的组织，要尽量把组织剪切成黄豆大小的块，使液氮迅速渗透到组织内部而防止组织内部的RNA降解。组织用铝箔包好或放入冻存管中，并做好记号，注意不要把记号写在纸上，以防纸被组织的血水渗透而导致记号模糊。可以把铝箔放入纱布袋并储存在液氮中。

2、在抽提RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷。从液氮罐中取出样本后，把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干。一次研磨的组织块重量不要超过300mg。

3、研磨到组织样品成粉末状后

1. 组织样品：称取 20mg-50mg 样品，使用液氮研磨或者匀浆器匀浆，加入 RNA-Solv ? Reagent裂解

2. 室温静置 2-3 分钟。

3. 加入 200μl 氯仿(氯仿的使用量为 1/5 RNA-Solv ? Reagent 的使用量） ，涡旋混匀 15 秒，冰浴 10 分钟。

4. 4℃，12,000×g 离心 15min。

5. 小心转移不大于 80%的水相层至新的离心管，加入 1/3 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀 15 秒。

6. 将 HiBind RNA 结合柱套在 2ml 离心管中， 转移不大于 700μl 混合液至 HiBind RNA 结合柱中。

室温下 10,000×g 离心 1 分钟，弃滤液。

7. 重复步骤六，直至所有的混合液全部离心，结合到 HiBind RNA 结合柱上。

8. 将 HiBind RNA 结合柱套在新的 2ml 离心管中， 加300μl RNA Wash Buffer I 至 HiBind RNA 结合柱中，10,000×g 离心 1 分钟，弃滤液； 9. （选做）DNase I 消化:

a. 配制 DNase I(Digestion Buffer, 73.5μl; RNase-Fr

总RNA提取（TRIzol法）

仪器和材料：氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头（1000μL，200μL，

10μL）、移液枪、无RNA酶EP管（有1.5mL、2mL、15mL、50mL等不同规格）、75%乙醇（尽量现配现用，配制好后置于4℃冰箱待用）、滤纸、DEPC水、计时器记号笔等

注：上述材料标记好提RNA专用，自己保管好！

操作步骤：

1．细胞悬液按照每5×105~106个细胞加1mL TRIzol，贴壁细胞直接加TRIzol裂解，（1个T25cm2细胞培养瓶可加1~2mL TRIzol，可根据需求来添加），裂解数分钟（5~10分钟，可在倒置显微镜下观察细胞脱落情况），反复用枪吹打或持续振荡以裂解细胞。

2．将上述TRIzol裂解液转移至1.5mL EP管中，每个EP管做好标记，按照每1mL TRIzol加200μL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，用力振荡（手动）15秒，在室温下放置10~15分钟（观察到明显分层即可）；然后4℃离心机12000rpm离心15分钟。

3．将离心后EP管内上层液体转入新的EP管内（离心后分为3层，注意吸取第一层水相时不要吸到第二层，一般可吸到500μL左右），按照每1mL TRIzol加500μL异丙

RNA提取标准流程

原理：

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol使样品细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。

预防RNase污染注意事项：

1． 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。 2． 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

3． RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高压灭菌，然后烘干即可。

4． 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.05% v/v，充分混匀后37oC放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）

RNA的提取

准备试剂：氯仿，异丙醇（可保存在-20oC，用时取出置于冰上），75%乙醇，无RNase的水。所有.溶液均需用0.05% DEPC处理过的水配制。10×Loading buffer（宝生物工程（大连）有限公司，货号：D603，35元，1mL×5支）

准备器材：1 mL、200 μL枪头、小烧杯*3、1.5 mL Epp

RNA纯化作为分子生物学实验的起始实验由于其繁杂的抽提过程且稍不注意样品容易被RNA酶降一直困扰着诸多的科研人员。针对于不同的样本应该采取不同的处理方法和抽提方式。细胞样品是几类样本当中最容易抽提的样本，裂解充分且不易降解；动物组织则相对较难，一是样本容易从活体脱离之后容易被降解，第二是有一些样本不容易打碎裂解，比如骨组织、肌肉组织等；而植物组织抽提RNA最常见的是杂质多。本文从采集样品开始来一一解决您RNA纯化过程中的难题。

一、抽提RNA的目的及各实验对RNA抽提样本的要求：

1、cDNA文库、芯片实验要求RNA完整性而无酶反应抑制物残留； 2、Northern对RNA的完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低； 3、RT实验堆RNA完整性要求不高，但RACE实验除外，但由于通常下游做PCR实验，所以对酶反应抑制物要求较高。

二、各样品中RNA的含量

高丰度（2-4ug/mg）：肝脏、胰脏、心脏

中丰度（0.05-2 ug/mg）：脑、胚胎、肾脏、肺、胸腺、卵巢 低丰度（＜0.05 ug/mg）：膀胱、骨、脂肪

三、样品的采集与保存

在样品离开活体之后或者离开了原来的生长环境，内源性的RNA酶释放出来会马上降解RNA，降解的

CTAB方法提取RNA

叶片RNA的提取

（1）取叶片材料两克，液氮中研磨成细粉末。

（2）每管加入10ml65℃预热的CTAB提取液和500 l β-巯基乙醇，剧烈涡旋匀浆，65℃水浴温育30min。

（3）每管加入10ml氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴10min。4℃，12000rpm离心10min。

（4）取上清，加入1∕3体积的8M LiCl和500 l β-巯基乙醇，-20℃沉淀过夜。

（5）4℃，12000rpm离心20min。

（6） 弃上清，沉淀用4ml异硫氰酸胍变性液溶解，加入120 l β-巯基乙醇和880 l 2M Na Ac (pH4.0),混匀后加入5ml的酚：氯仿：异戊醇（25：24：

1）， 涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（7）取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（8）取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（9）取上清，加入1∕10体积的3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置过夜。

（10）4℃，14000rpm离心

RNA提取实验方法

1、准备工作：a、按照2.1.3.2收样方法，收取PH-1野生型分生孢子、菌丝（6h、12h、24h、36h）、9d子囊壳。b、200℃高温对研钵和研磨棒灭菌。c、电泳槽用3%的H2O2浸泡过夜后用去离子水洗净待用。d、用70%酒精将超净工作台和研磨样品所需的桌面擦洗干净。

2、将样品倒入液氮预冷的研钵中，迅速研磨（3次），待将要液氮挥发完全时，将样品粉末倒入RNA专用离心管内。加入1ml Trizol，涡旋震荡至混合均匀。

3、静置10min后，加入200μL氯仿上下翻转至混合均匀。 4、4℃，1000rpm离心15min

5、将上部澄清液转移到新的无菌的1.5ml离心管中，然后加入等体积与管内溶液的异戊醇。

6、静置15min后，4℃离心机10000rpm，15min。 7、倒去上清，加入1ml的75%乙醇。洗涤沉淀。

8、7500rpm，4℃，离心5min，倒去上部澄清液，置于超净台中吹干。 9、加入100-200μL的DEPC水溶解沉淀。 10、溶解后取5μL稀释10倍测RNA浓度。 11、电泳检测。 DNA的消解

1、在1.5ml离心管中配制以下反应体系：

Total RNA

10×DNaseI reacting

液氮研磨组织提取RNA步骤

一、试剂与耗材（RNA提取专用，无RNase）

75%的酒精（用无酶水配制），RNase Zap， Trizol(Invitrogen)，氯仿，异丙醇，无RNA酶水（Ambion）；研钵，研杵，1.5ml EP管，2.0ml EP管，15ml 管，50ml 管，棉纱布。 二、操作步骤

1) 用75%酒精对实验操作台、移液枪、枪头盒、管架进行消毒，然后再用RNase Zap擦拭上述材料。

2) 取出-80℃冰箱保存的组织块，放于用液氮预冷过的研钵中，敲碎一小块组织，其余放回冻存管。

3) 加入液氮，先轻轻敲碎组织到最小块，再研磨成粉末，直到看不到组织块。

4) 加入液氮使粉末凝聚成团，马上用药勺把粉末转移到2.0ml EP管中。

5) 待液氮挥发干后，加入1ml Trizol裂解液，用1ml移液器将细胞吹散开，保证细胞裂解充分，必要时可借助水平振荡器混匀。 6) 4℃离心机12000rpm离心5分钟,弃沉淀。注：此时可放入-80℃低温冰箱长期保存。

7) 加入氯仿，比例200ul氯仿/ml Trizol，颠倒混匀，室温放置15分钟。

8) 于4℃离心机12000g离心15分钟。取上清液（上层为水相，中间层为蛋白，下层