质粒dna的提取中三种溶液的作用

质粒DNA的提取、纯化与纯度鉴定

李笃财 生科

1班 201200140048

【实验目的】

1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理。 【实验原理】

1. 质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离

实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化

一、实验目的

学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。

二、实验原理

在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。

三、实验材料

大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）

四、实验仪器、用具

高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪

五、实验试剂

LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖 抽提质粒DNA所需的溶液：

山东大学实验报告

姓名 宿智新 学院 生命科学学院 班级 11级生工2班 科目 分子生物学实验 学号 201100140155 第 8 组

质粒DNA的提取、纯化与鉴定

摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌DH5?（E.coli DH5?）中提取pUC19质粒，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。同时通过对质粒DNA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DNA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。 关键词：碱变法 质粒 电泳 实验目的：

1. 学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2. 学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3. 学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4. 掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5. 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 实验原理：

1. 质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度

质粒DNA的提取、纯化及验证

一、实验目的

1、掌握碱变性提取法质粒DNA的原理、方法及各种试剂的使用 2、掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理和方法。 二、实验材料、试剂及器具 1、材料

E.coliDH 5α（pUC 19 vector） 2、试剂

1)LB培养基 2)TE缓冲液 3)裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ 4)无水乙醇 5)70%乙醇 6）苯酚、氯仿 7)氨苄青霉素 3、器具

离心机、离心管、枪尖、移液枪 三、实验步骤 1、质粒提取

取LB平板上E.coliDH 5α（pUC 19 vector）→接种到LB+AP(20ml)培养基37℃,过夜培养→第二天早晨转接到LB+AP(50ml)培养基中，37℃，4-6h→称离心管空管重量W1，取约40ml菌液（装到离管上缘1cm处）→7000rpm离心5min→弃上清，加5ml溶液Ⅰ,涡旋打散菌泥洗涤再离心（7000rpm,5min）→弃上清，干燥，称重W2→每100ml菌泥加入溶液Ⅰ1ml,涡旋，冰浴5min→按量加入溶液Ⅱ2ml,轻加轻摇，冰浴5min→按量加入溶液Ⅲ1.5ml,轻加轻摇，冰浴10min→12000rpm,15min→转上清液至新管，加1/10V 3mol/

辣木叶中黄酮的提取具体操作流程

1.1材料与试剂

辣木叶，老师提供；芦丁标准品、分析纯无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝，氢氧化钠等。

1.2仪器与设备

KQ-300DE型数控超声波清洗器；电子分析天平；AnkeTDL-5-A离心机；紫外/可见分光光度计。

1.3辣木叶总黄酮的提取方法

取干燥的辣木叶，粉碎过40目筛。准确称取辣木叶粉1.0g，置于100mL烧杯中，加入体积分数为80%的乙醇溶液超声提取，提取液离心分离，测定总黄酮的含量。

具体操作流程：辣木叶→干燥→磨粉→过40目筛→超声提取→离心→上清液→测定总黄酮含量。

1.4总黄酮的测定方法 1.4.1芦丁标准曲线的绘制

准确称取干燥至恒重的芦丁标准品20mg，用体积分数为80%的乙醇溶液溶解，定容至25mL，配制得到质量浓度为0.80mg/mL的芦丁标准溶液。准确吸取新配制的芦丁标准溶液0、125、250、500、625、750、1500μL于10mL的比色管中，加入体积分数80%的乙醇溶液至9mL，加入5%的Na-NO2溶液300μL，摇匀，放置6min。加入10%的Al（NO3）3溶液300μL，摇匀，放置6min，再加入1mol/L的NaOH溶液500μL，摇匀，静置10～15min。

辣木叶中黄酮的提取具体操作流程

1.1材料与试剂

辣木叶，老师提供；芦丁标准品、分析纯无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝，氢氧化钠等。

1.2仪器与设备

KQ-300DE型数控超声波清洗器；电子分析天平；AnkeTDL-5-A离心机；紫外/可见分光光度计。

1.3辣木叶总黄酮的提取方法

取干燥的辣木叶，粉碎过40目筛。准确称取辣木叶粉1.0g，置于100mL烧杯中，加入体积分数为80%的乙醇溶液超声提取，提取液离心分离，测定总黄酮的含量。

具体操作流程：辣木叶→干燥→磨粉→过40目筛→超声提取→离心→上清液→测定总黄酮含量。

1.4总黄酮的测定方法 1.4.1芦丁标准曲线的绘制

准确称取干燥至恒重的芦丁标准品20mg，用体积分数为80%的乙醇溶液溶解，定容至25mL，配制得到质量浓度为0.80mg/mL的芦丁标准溶液。准确吸取新配制的芦丁标准溶液0、125、250、500、625、750、1500μL于10mL的比色管中，加入体积分数80%的乙醇溶液至9mL，加入5%的Na-NO2溶液300μL，摇匀，放置6min。加入10%的Al（NO3）3溶液300μL，摇匀，放置6min，再加入1mol/L的NaOH溶液500μL，摇匀，静置10～15min。

辣木叶中黄酮的提取具体操作流程

1.1材料与试剂

辣木叶，老师提供；芦丁标准品、分析纯无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝，氢氧化钠等。

1.2仪器与设备

KQ-300DE型数控超声波清洗器；电子分析天平；AnkeTDL-5-A离心机；紫外/可见分光光度计。

1.3辣木叶总黄酮的提取方法

取干燥的辣木叶，粉碎过40目筛。准确称取辣木叶粉1.0g，置于100mL烧杯中，加入体积分数为80%的乙醇溶液超声提取，提取液离心分离，测定总黄酮的含量。

具体操作流程：辣木叶→干燥→磨粉→过40目筛→超声提取→离心→上清液→测定总黄酮含量。

1.4总黄酮的测定方法 1.4.1芦丁标准曲线的绘制

准确称取干燥至恒重的芦丁标准品20mg，用体积分数为80%的乙醇溶液溶解，定容至25mL，配制得到质量浓度为0.80mg/mL的芦丁标准溶液。准确吸取新配制的芦丁标准溶液0、125、250、500、625、750、1500μL于10mL的比色管中，加入体积分数80%的乙醇溶液至9mL，加入5%的Na-NO2溶液300μL，摇匀，放置6min。加入10%的Al（NO3）3溶液300μL，摇匀，放置6min，再加入1mol/L的NaOH溶液500μL，摇匀，静置10～15min。

比较Activiti中三种不同的表单及其应用

这个恐怕是初次接触工作流最多的话题之一了，当然这个不是针对Activiti来说的，每个工作流引擎都会支持多种方式的表单。目前大家讨论到的大概有三种。

1. 动态表单 2. 外置表单 3. 普通表单

1.动态表单

这是程序员最喜欢的方式，同时也是客户最讨厌的……因为表单完全没有布局，所有的表单元素都是顺序输出显示在页面。

此方式需要在流程定义文件(bpmn20.xml)中用activiti:formProperty属性定义，可以在开始事件（Start Event）和Task上设置，而且支持变量自动替换，语法就是UEL。 ? 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

下面是一个简单的动态表单的单元测试，读者可以下载运行以便更明确执行过程和判断动态表单能不能在企业项目中使用。

DymaticForm.bpmn

ProcessTestDymaticForm.java

? ?

下载之后复制到eclipse工程里，更改里面的路径配置使用JUnit测试即可。 当流程需要一些特殊处理时可以借助Listener或者Delegate方式实现。

注意：表单的内容都是以key和value的形式数据保存在引擎表中！！！

繁小星整理

力学中三种常见力及物体的平衡 ............................................... 5

1、力的概念的理解 ...................................................... 5 2、对重力概念理解 ...................................................... 5 3、弹力 ................................................................ 6 4、摩擦力 .............................................................. 6 力的合成与分解、共点力作用下物体的平衡 ..................................... 6

1、合力与分力 .......................................................... 6 2、平行四边形定则 ..........................................

实验一 质粒DNA的小量制备

（碱裂解法）

一、

实验原理

所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：

①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。

本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。碱裂解法对于以前应用的所有大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是：加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。

环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），