基因工程DNA重组

重组DNA技术与基因工程1 2 3 4 5 6 重组DNA技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程

目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母中的表达

5 外源基因在大肠杆菌中的表达A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定

被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物

5 外源基因在大肠杆菌中的表达A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白

细胞周质内含有种类繁多的内毒素

5 外源基因在大肠杆菌中的表达B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子 终止子

核糖体结合位点密码子 质粒拷贝数

启动子 启动子最佳距离的探测A

目的基因 E E

启动子

目的基因 E E

A 酶切开

Bal31酶解

启动子 启动子的筛选采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段

克隆到启动子探针质粒pKO1上。 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk

基因工程的重组连接 ——DNA连接酶

DNA连接酶

概念：DNA连接酶存在于各种生物体内，其催化的基本 反应形式是将DNA双链上相邻的3 ’羟基和5’磷酸基团共 价形成3 ’ -5’磷酸二酯键，使断开的DNA切口连接起来， 因此它在DNA复制、修复以及体内体外的重组过程中起 重要作用。 分类： 1. E.coli DNA ligase:需要烟酰胺腺嘌呤（NAD+）作辅助因 子， NAD+ +酶 酶-AMP，同时释放出烟酰胺单核 苷酸（MMN） 活化的酶复合物在DNA切口处修复磷 酸二酯键，并释放AMP。 2. T4 DNA ligase：由T4噬菌体基因编码，分子量约为 60KDa。其活性以ATP为辅助因子，它与酶形成复合物， 并释放磷酸焦磷酸基团。

DNA连接酶

目前基因工程所使用的DNA连接酶多是来源于T4噬菌体 的T4DNA连接酶，因为它与大肠杆菌DNA连接酶相比， 具有以下特点： 修复双链DNA上的单链缺口（二者均相同），这是两种 DNA连接酶的基本特征； 连接DNA-RNA杂交双链上的DNA或RNA缺口，其中后 者反应速度较慢； 连接完全断开的2个平头双链DNA分子，反应速度通常 是粘头连接的1/10-1/100，因此这种反应属于分子间连

第14章

基因重组和基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering

目录

DNA克隆、测序与重组技术的历史 1973年，Stanley Cohen等人首次获得体外 重组DNA的分子克隆 1977年，Allan Maxam和Walter Gilbert的 化学裂解DNA测序问世 不久，Sanger 等的双脱氧测序法

20世纪90年代启动人类基因组计划(human genome project,HGP) 重组DNA技术学(Recombinant DNA Technology)目录

第一节

自然界DNA重组和基因转移 是经常发生的DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目录

DNA重组 一、同源重组 (homologous recombination) 二、细菌的基因转移和重组

1、接合作用 (conjugation) 2、转化作用 (transformation)3、转导作用 (transduction)

三、位点特异的重组(site-specific recombination) 四、转 座 (transpos

第14章

基因重组和基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering

目录

第一节

自然界DNA重组和基因转移 是经常发生的DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目录

第二节 重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone

目录

重组DNA技术的发展史1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传 工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的

药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。

目录

本节主要内容： 相关概念

DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体

基本原理 重组DNA技术与医学的关系

目录

一、重组DNA技术相关概念(一)

基因工程载体

---乳酸菌表达载体pMG36e及其应用现状

目前，多数外源基因的克隆与表达，主要采用大肠杆菌。然而，由于大肠杆

菌能够引起人类和动物发生不同程度的腹泻，导致机体损伤，所以其表达产物需要经过复杂的分离纯化才能达到食品医药标准。与之相比，乳酸菌作为人和动物肠道内正常菌群之一，已被证明具有诸多益生功能，而且被公认为安全无毒的 (Generally regarded as safe，GRAS)。因此，采用乳酸菌表达的外源蛋白质可免去上述复杂、繁琐的后提纯工艺；同时，乳酸菌可以在肠道中存活定植，其外源基因表达用于治疗或免疫作用的活性物质可以持续地在肠道中产生，成为人和动物体内功能性生物制剂的“加工车间”，从而起到相应的保护和治疗性作用。

乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）是一类能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌［1］，具有诸如缓解乳糖不耐症、调节消化道微生态平衡等益生作用，应用领域十分广泛。随着近二十几年来分子生物学的发展，以乳酸菌作为宿主，利用质粒表达外源基因，对乳酸菌进行改造以进一步提高其功能已成为目前的研究热点之一。乳酸菌常用质粒载体主要有pWV01衍生载体，pNZ系列载体［2］等。质粒pMG36e来源

基因工程试题库

001 基因工程操作的三大基本元件是【 】 I 供体 II 受体 III 载体 IV 抗体 V 配体 Ａ I + II + III Ｂ I + III + IV Ｃ II + III + IV Ｄ II + IV + V Ｅ III + IV + V

002 根据当今生命科学理论，基因工程的用途是【 】

I 分离纯化基因 II 大量生产生物分子 III 构建新型物种 IV 提高基因重组效率 Ａ I + II + III Ｂ I + II + IV Ｃ I + III + IV Ｄ II + III + IV

Ｅ I + II + III + IV

003 基因工程的三大理论基石是【 】 Ａ 经典遗传学、细胞生物学、微生物学 Ｂ 分子遗传学、分子生物学、生化工程学 Ｃ 动物学、植物学、微生物学

Ｄ 生物化学、生化工程学、化学工程学 Ｅ 生理学、仿生学、免疫学

004 根据基因工程的定义，下列各名词中不能替代基因工程的是【 】 Ａ 基因诱变 Ｂ 分子克隆 Ｃ DNA重组 Ｄ 遗传工程

Ｅ 基因无性繁殖

005 基因工程的单元操作顺序是【 】 Ａ 增，转，检，切，接 Ｂ 切，接，转，增，检 Ｃ 接，转，增，检，切 Ｄ 检，

幻灯片1

基因工程

（GENETIC ENGINEERING）

幻灯片2

第一节 概 述

幻灯片3

基因工程技术的定义

用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种DNA分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的实验工程技术。

幻灯片4

DNA重组(DNA recombination)

DNA重组（DNA recombination）：不同来源的DNA分子末端通过磷酸二酯键共价连接，形成重新组合的DNA分子。 幻灯片5

克隆（clone）

克隆（clone）:由一个细胞经无性繁殖而形成的细胞群体。 幻灯片6

分子克隆(molecular cloning)

分子克隆（molecular cloning）:指建立单一的重组DNA的无性系的过程。即指在体外制备DNA，切割拼接成重组D

1.动物细胞DNA提取原理是什么?

答：先用SDS裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。然后用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，使蛋白质变性沉降到酚与水相的界面，DNA则留在水相中，离心后在上清液中加入醋酸钠和两倍体积无水乙醇，除去多糖物质和沉淀DNA，然后离心后沉淀用70%乙醇洗涤，最后用ddH2O溶解沉淀DNA，－20℃保存。 2.DNA提取中用到了哪些试剂？有什么作用？

EDTA:二价金属离子螯合剂，螯合Mg2+，抑制DNA酶活性。因为Mg离子是DNA酶的辅因子。

SDS:一种阴离子去污剂，在高温（55℃—65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。 酚:使蛋白质变性。

氯仿:作为除杂剂，除去糖、脂等杂质；加速有机相与液相分离；抽提核酸溶液中残留的酚。 乙丙醇:作为消泡剂；降低DNA的水溶性，让DNA从溶液中析出；有利于分层，使离心后的上层含DNA水相，中间的蛋白质相及下层有机溶液相维持稳定。 无水乙醇:降低DNA的水溶性，沉淀DNA。

醋酸纳:调PH，中和Tris-Buffer，形成中性环境，利于DNA沉淀。 Tris-Buffer（PH8.0）:提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。 70％乙醇:清洗溶液中离子及

基 因 工 程 讲 义

主讲教师──陈永胜

1

目 录

第一章 绪 论???????????????????3

一、基因工程的诞生???????????????????3 二、基因工程的成就???????????????????5 三、基因工程安全性的问题???????????????? 6 四、基因工程研究的内容????????????????? 8

第二章 基因克隆所需的工具酶??????????? 12

一、限制性内切酶(restriction enzyme)????????????

12

二、DNA连接酶???????????????????? 20 三、DNA聚合酶???????????????????? 24 四、逆转录酶????????????????????? 27

第三章 基因的克隆载体 ?????????????? 28

一、质粒载体????????????????????? 28 二、大肠杆菌质粒载体 ????????????????? 30 三、λ噬菌体载体????????????????????33 四、粘粒载体（柯斯质粒载体）??????????????

基因工程试卷B

一． 名词解释（每个2分，共20分）

1、转化:

2、质粒转移性:

3、DNA文库:

4、RACE:

5、选择标记基因:

6、降落PCR

7、载体:

8、感受态细胞:

9CaMV35s:

10、ORF:

二、选择题（每题1分，共15分）

1( ) 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是

A 修复自身的遗传缺陷 B 促进自身的基因重组 C 强化自身的核酸代谢 D 提高自身的防御能力 2( )生物工程的下游技术是

A 基因工程及分离工程 B 蛋白质工程及发酵工程 C 基因工程及蛋白质工程 D分离工程 及蛋白质工程

3 ( )基因工程操作常用的酶是:(I 内切酶II 连接酶III 末端转移酶IV聚合酶

A. I + II B. I + III + IV C. II + III + IV D. I +II + IV + III 4 ( )限制性内切核酸酶的星活性是指：

A 在非常规条件下，识别和切割序列也不发生变化的活性。 B 活性大大提高 C 切割速度大大加快 D识别序列与原