谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究酶活力的测定

X X X大学

生物化学实验技术

生命科学学院

专业：X X X X X X X X X

姓名：X X X

2013/X/X

【摘要】 酶学研究是生物化学研究中的重要领域。谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，GSTs）是一类广泛存在于动物和人体各种组织中的参与解毒作用的同工酶家族,其中在哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10 %。本实验利用亲和层析法纯化谷胱甘肽转硫酶，以1-氯-2,4-二硝基苯（ CDNB） 为底物，研究酶促反应动力学的特性，加深对酶促反应的特点的理解。利用分光光度法测定了 GST 的酶活力为0.089 IU，用考马斯亮蓝G-250染色法测定GST的比活力为11.125 μmol/min?mg，用直线作图法得出了 GST 的米氏常为0.26 mmol/L，最大速率0.029μmol/L?min。

1

谷胱甘肽转硫酶的制备

及动力学研究

2

谷胱甘肽转硫酶的制备及

动力学研究

【摘要】 酶学研究是生物化学研究中的重要领域。谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，GSTs）是一类广泛存在于动物和人体各种组织中的参与解毒作用的同工酶家族,其中在哺乳动物

X X X大学

生物化学实验技术

生命科学学院

专业：X X X X X X X X X

姓名：X X X

2013/X/X

【摘要】 酶学研究是生物化学研究中的重要领域。谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，GSTs）是一类广泛存在于动物和人体各种组织中的参与解毒作用的同工酶家族,其中在哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10 %。本实验利用亲和层析法纯化谷胱甘肽转硫酶，以1-氯-2,4-二硝基苯（ CDNB） 为底物，研究酶促反应动力学的特性，加深对酶促反应的特点的理解。利用分光光度法测定了 GST 的酶活力为0.089 IU，用考马斯亮蓝G-250染色法测定GST的比活力为11.125 μmol/min?mg，用直线作图法得出了 GST 的米氏常为0.26 mmol/L，最大速率0.029μmol/L?min。

1

谷胱甘肽转硫酶的制备

及动力学研究

2

谷胱甘肽转硫酶的制备及

动力学研究

【摘要】 酶学研究是生物化学研究中的重要领域。谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，GSTs）是一类广泛存在于动物和人体各种组织中的参与解毒作用的同工酶家族,其中在哺乳动物

实验26 过氧化氢酶活力的测定（必修）

[目的与原理]

掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法，并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。

血清中的过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应，可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，即可计算出CAT的活力，CAT活力单位定义为：每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。 [试剂与器材] 试剂：

1、磷酸盐缓冲液（67mmol / l，pH=7.4）：取Na2HP04 7.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸馏水中，调pH至7.4。

2、基质液（65μmol/ l, H2O2）：取30% H2O2 3.69 ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。 3、钼酸铵：称取［(NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸馏水中。 器材：

721分光光度计 , 0.5cm比色杯，恒温水箱（37℃±0.5℃），试管 16mm×100mm，移液管，吸耳球，可调微量进样器。 [实验步骤]

1、样品测定：基质液置于37℃水浴 5 min，然后按下列步骤操作 试剂 基质液 钼酸铵 缓冲液 血清

对照管 1.0

实验六 乳酸脱氢酶酶活力测定 及紫外吸收法测定蛋白质含量

目的要求

(1) 掌握LDH活性测定原理；

(2) 学习用比色法测定酶活性的方法。

实验原理

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。

LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为

简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位。定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。

利用上述原理，改变不同第五则可测定相应脱氢酶反应过程中A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢

酶动力学综合实验

实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定

【目的要求】

1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响

2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。 【实验原理】 1、碱性磷酸酶：

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。 2、米氏方程：

Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：

错误！未找到引用源。 (1)

式中：v表示酶促反应速度，

错误！未找到引用源。表示酶促反应最大速度， [S]表示底物浓度，

错误！未找到引用源。表示米氏常数。

3、 错误！未找到引用源。值的测定主要采用图解法，有以下四种： ①双曲线作图法（图1-1，a） 根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2错误！未找到引用源。时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测错误！

酶工程Enzyme Engineering周海岩 牛坤 王亚军 博士

浙江工业大学生物与环境工程学院

酶催化历程1 Substrates enter active site; enzyme changes shape so its active site embraces the substrates (induced fit).2 Substrates held in active site by weak interactions, such as hydrogen bonds and ionic bonds. 3 Active site (and R groups of its amino acids) can lower EA and speed up a reaction by acting as a template for substrate orientation, stressing the substrates and stabilizing the transition state, providing a favorable microenvironment, participating directly

酶动力学综合实验

实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定

【目的要求】

1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响

2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。 【实验原理】 1、碱性磷酸酶：

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。 2、米氏方程：

Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：

错误！未找到引用源。 (1)

式中：v表示酶促反应速度，

错误！未找到引用源。表示酶促反应最大速度， [S]表示底物浓度，

错误！未找到引用源。表示米氏常数。

3、 错误！未找到引用源。值的测定主要采用图解法，有以下四种： ①双曲线作图法（图1-1，a） 根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2错误！未找到引用源。时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测错误！

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2

生物化学实验报告

题目：纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法）

姓名： 学号： 班级： 时间：

一、

实验目的：

掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。

二、

实验原理：

纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。 三、

实验试剂：

1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10g 3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，

加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500ml，升温溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2. 0.1摩尔pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 4. 标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，

此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。

5. 酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待

测。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制）

四、

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2