提取mirna的方法

miRNA研究方法

尽管早在1993年，科学家就发现了第一个microRNA，但直到2003年以后，这种小RNA分子的大作用才不断被发现。研究显示：miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达，影响了30%的基因。miRNA在多个组织中，例如正常和肿瘤组织中差异表达。因此，通过表达谱分析寻找疾病相关miRNA并进行发病机理研究，最终应用于肿瘤诊断和治疗，已经成为目前miRNA研究的重要方向。在研究中，从深度测序、miRNA芯片到通过导入化学合成的mimics/antagomirs等实现miRNA过表达和抑制，都是研究中常用的方法。同时，在miRNA研究中，生物信息学分析扮演着越来越重要的角色。

下表介绍了miRNA研究和应用中科学家关注的主要科学问题以及目前常用的研究方法。

miRNA主要研究技术

深度测序 抽提分离小分子（例如18-30nt）RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA（miRNA-known）、新的miRNA（miRNA-new）以及可能的新miRNA（miRNA-cadida

组织miRNA提取(E.Z.N.A. miRNA Kit)

器具和耗材

E.Z.N.A. miRNA试剂盒 、加样器一套、涡旋器、离心机、离心管架、各种规格离心管（15ml、1.5ml、）、RNase-free的各种规格吸头（1ml、200ul、10ul）、镊子、研钵、研棒、保温杯（盛液氮用） 试剂：

氯仿、75%乙醇、100%乙醇、RNase-free水 操作步骤： 准备工作

1. 实验前1天将研钵和研棒放在84消毒液中浸泡24小时，实验前30min加入液氮冷却。 2. 实验前清理实验台面，用75%乙醇擦拭台面2篇，喷洒RNase-free水于台面和要用的器械盒试剂盒；

3. 将15ml离心管在液氮中提前预冷。

4. RWB Wash Buffer中加入48ml无水乙醇。

5. 将冻存样品从-70℃冰箱转移至装有液氮的保温杯中。

组织研磨和匀浆

1. 取冰冻组织材料50－100mg置于放有液氮的研钵中，在研钵中加液氮研磨成粉末（尽量细），注意持续补充液氮； 2. 用在液氮中预冷的1ml吸头转移组织粉末至提前预冷的15ml离心管中 3. 待液氮完全蒸发后加入1mlRNA-Solv试剂，室温下孵育2-3min

4. 每1mlRNA-Solv试

组织miRNA提取(E.Z.N.A. miRNA Kit)

器具和耗材

E.Z.N.A. miRNA试剂盒 、加样器一套、涡旋器、离心机、离心管架、各种规格离心管（15ml、1.5ml、）、RNase-free的各种规格吸头（1ml、200ul、10ul）、镊子、研钵、研棒、保温杯（盛液氮用） 试剂：

氯仿、75%乙醇、100%乙醇、RNase-free水 操作步骤： 准备工作

1. 实验前1天将研钵和研棒放在84消毒液中浸泡24小时，实验前30min加入液氮冷却。 2. 实验前清理实验台面，用75%乙醇擦拭台面2篇，喷洒RNase-free水于台面和要用的器械盒试剂盒；

3. 将15ml离心管在液氮中提前预冷。

4. RWB Wash Buffer中加入48ml无水乙醇。

5. 将冻存样品从-70℃冰箱转移至装有液氮的保温杯中。

组织研磨和匀浆

1. 取冰冻组织材料50－100mg置于放有液氮的研钵中，在研钵中加液氮研磨成粉末（尽量细），注意持续补充液氮； 2. 用在液氮中预冷的1ml吸头转移组织粉末至提前预冷的15ml离心管中 3. 待液氮完全蒸发后加入1mlRNA-Solv试剂，室温下孵育2-3min

4. 每1mlRNA-Solv试

已有文献报道表明,等量的miRNA mimics 和pre-miRNA 进入体外或体内时,pre-miRNA能更特异地且高效的形成mature miRNA,并表现出更高的生物学活性。鉴于pre-miRNA 具有高效、低细胞毒性的特点,我们合成了pre-miR-21 和miRNA mimic,以相同剂量转染细胞,然后用RT-PCR 检测miRNA-21 成熟体的形成。试验结果表明效果远优于mimics,因此pre-miRNA在系统多因素的研究中具备其更独特的优势!

使用siRNA、miRNA mimic 、pre-miRNA进行miRNA 生物学功能研究的区别

Frank 20120715

miRNA是一类大小约为22个碱基的小RNA分子。它们在转录后阶段对基因表达进行调控。调控机制是通过与靶基因的mRNA互补序列结合，抑制蛋白质的 翻译或降低mRNA的稳

定性，从而抑制靶基因的表达。科研人员已逐步认识到miRNA在细胞的发育，分化，生长等生命活动中起着非常重要的调控作用，因此越来越多的科研人员把目光聚焦到这一领域，并期待能一窥miRNA的科学奥妙。

成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，初级转录物称为pri-miRN

综述中药提取方法

摘要 以中药提取方法的本质和影响提取作业的因素为理据，分析国内中药厂提取方法 关键词 中药提取方法 1前沿

近年来有关中药提取方法的论述有很多，然而有效成分的提取率仍然是现今国内中药制药工业现代化的瓶颈。尽管近年来国内在中药提取生产中推出了一些新工艺，如超声场强化提取、微波提取、超临界流体提取等，但当下的主流仍是浸提技术。浸提技术是应用溶剂提取固体原料中某一或某类成分的提取分离操作，又称固液萃取。目前在中药生产过程中，常用的中药浸提方法有煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流法、水蒸气蒸馏法等。

面对众多中药提取方法如何抉择是一个复杂的问题，因为它牵涉到生产设备和生产条件等许多因素。加上如今中药提取的规模较大，尤其考虑到连续生产，即使在实验中取得成果，在实际情况下还要经过长时间的实践检验。还有前面提到过的提取新工艺，其提取物往往是化学结构明确的物质，与传统中药生产完全是两回事，所以生产传统中药的厂家下不了决心去尝试新工艺，生产者情愿随大流，以避免风险。

提取方法的不同，提取等量有效成分所需原料和能源

也不尽相同，资源和能源对世界经济和人类生存环境的影响越来越被重视。可持续发展经济和资源节约型社会的概念已经被全世界广泛认同

DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒中文操作说明书 作者: Allanflying (站内联系TA) 发布: 2012-09-11

一．利用DNeasy? Blood & Tissue试剂盒提取样本总DNA 1．前处理： 注意：

1） 石蜡包埋组织的DNA一般小于650bp，还要视样本类型与保存年限而定。 2） 固定剂一般为福尔马林或酒精。不推荐用蛾酸固定的样本。 3） 溶解时间随样本类型和溶解状态而定。 4） 产量视样本类型和保存年限而定。推荐用50-100ul的AE缓冲液洗脱纯化的DNA。 5） 开始前要预热孵化器或水浴锅至37℃，用于操作步骤9）。 1.石蜡包埋组织的前处理 操作步骤：

1） 将小片石蜡包埋的组织（小于25mg）放入2ml离心管中（自备）。 2） 加入1200ul的二甲苯，用力涡旋震荡。 3） 最大转速室温（15-25°）离心5分钟。 4） 移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。

5） 往沉淀中加1200ul的

已有文献报道表明,等量的miRNA mimics 和pre-miRNA 进入体外或体内时,pre-miRNA能更特异地且高效的形成mature miRNA,并表现出更高的生物学活性。鉴于pre-miRNA 具有高效、低细胞毒性的特点,我们合成了pre-miR-21 和miRNA mimic,以相同剂量转染细胞,然后用RT-PCR 检测miRNA-21 成熟体的形成。试验结果表明效果远优于mimics,因此pre-miRNA在系统多因素的研究中具备其更独特的优势!

使用siRNA、miRNA mimic 、pre-miRNA进行miRNA 生物学功能研究的区别

Frank 20120715

miRNA是一类大小约为22个碱基的小RNA分子。它们在转录后阶段对基因表达进行调控。调控机制是通过与靶基因的mRNA互补序列结合，抑制蛋白质的 翻译或降低mRNA的稳

定性，从而抑制靶基因的表达。科研人员已逐步认识到miRNA在细胞的发育，分化，生长等生命活动中起着非常重要的调控作用，因此越来越多的科研人员把目光聚焦到这一领域，并期待能一窥miRNA的科学奥妙。

成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，初级转录物称为pri-miRN

DNA提取

191

论　著 　

线粒体DNA提取方法的比较3

李伟文　陆松敏　刘建仓　武　凡　李　萍　柏干荣

第三军医大学野战外科研究所(重庆,400042)

　　摘要　目的将提取线粒体DNA的碱变性法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线Triton法、粒体DNA的方法。方法分离Wistar大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase8亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA。结果改进高盐沉淀法线粒体DNA量最多,Triton法最少。OD260 ～1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于OD280均在1.78结论改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,PCR扩增,测定出了线粒体DNAATPase8亚基基因序列。产量多的优点,该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序。

关键词　线粒体;DNA;分子遗传学

　　1981年,Anderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA(mtDNA),进行了全序列分析。此后,mtDNA的研究日益得到重视。本实验将Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较,发现后者具有简便、经济、易重复等优点。1　材料和方法111112　细

细菌总蛋白的提取方法

细菌总蛋白和膜蛋白提取方法

一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法）

1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。

2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。

3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。

缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol裂解液中分离总蛋白

1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。

2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放

DNA提取

191

论　著 　

线粒体DNA提取方法的比较3

李伟文　陆松敏　刘建仓　武　凡　李　萍　柏干荣

第三军医大学野战外科研究所(重庆,400042)

　　摘要　目的将提取线粒体DNA的碱变性法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线Triton法、粒体DNA的方法。方法分离Wistar大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase8亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA。结果改进高盐沉淀法线粒体DNA量最多,Triton法最少。OD260 ～1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于OD280均在1.78结论改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,PCR扩增,测定出了线粒体DNAATPase8亚基基因序列。产量多的优点,该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序。

关键词　线粒体;DNA;分子遗传学

　　1981年,Anderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA(mtDNA),进行了全序列分析。此后,mtDNA的研究日益得到重视。本实验将Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较,发现后者具有简便、经济、易重复等优点。1　材料和方法111112　细