trizol法提取rna乙醇的作用

总RNA提取（TRIzol法）

仪器和材料：氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头（1000μL，200μL，

10μL）、移液枪、无RNA酶EP管（有1.5mL、2mL、15mL、50mL等不同规格）、75%乙醇（尽量现配现用，配制好后置于4℃冰箱待用）、滤纸、DEPC水、计时器记号笔等

注：上述材料标记好提RNA专用，自己保管好！

操作步骤：

1．细胞悬液按照每5×105~106个细胞加1mL TRIzol，贴壁细胞直接加TRIzol裂解，（1个T25cm2细胞培养瓶可加1~2mL TRIzol，可根据需求来添加），裂解数分钟（5~10分钟，可在倒置显微镜下观察细胞脱落情况），反复用枪吹打或持续振荡以裂解细胞。

2．将上述TRIzol裂解液转移至1.5mL EP管中，每个EP管做好标记，按照每1mL TRIzol加200μL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，用力振荡（手动）15秒，在室温下放置10~15分钟（观察到明显分层即可）；然后4℃离心机12000rpm离心15分钟。

3．将离心后EP管内上层液体转入新的EP管内（离心后分为3层，注意吸取第一层水相时不要吸到第二层，一般可吸到500μL左右），按照每1mL TRIzol加500μL异丙

Trizol法提取总RNA

1、①提取组织RNA时，研钵高温高压灭菌，每50-100mg组织液氮研磨后，将粉末用液氮预冷的药匙转移至预先装有1ml Trizol的EP管中，充分混匀（粉末总体积不能超过Trizol体积的10%）用1ml Trizol试剂裂解；

②提取细胞RNA时，每5-10×106个细胞用1ml Trizol裂解，反复吹打或剧烈振荡；

2、将上述裂解液，室温15-30℃静置5min；

3、每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，在手中用力振荡15s，室温放置2-3min后，12000r离心15min（2-8℃）；

4、取上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，室温放置10min，12000r离心10min（2-8℃），弃上清；

5、向沉淀中按每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇（4℃），涡旋混合，进行洗涤，7500r离心5min（2-8℃）,弃上清； 6、将RNA沉淀在室温下自然干燥（5-10min）； 7、用30μl RNase-free water溶解RNA沉淀； 8、取出1μl，稀释10倍，测定RNA浓度并记录； 9、进行反转录或分装保存于-80℃

Trizol法提取RNA步骤

1． 胰酶消化六孔板细胞（每孔相当于3.5cm皿），每孔细胞收于EP管中，PBS洗一遍（或

弃旧培养基，1ml PBSA洗2遍，直接向孔中加入600ul Trizol，吹打细胞，并吸入EP管中即可，无需胰酶消化）；

2． 向细胞沉淀中加入600ul Trizol裂解细胞5min；

3． 加入三氯甲烷（氯仿）120ul（V三氯甲烷：VTrizol=1:5）提取核酸； 4． 振荡10s至粉红色出现时停止，室温静置2~3min后分层； 5． 4℃，12000×g，离心15min，离心后，底部为细胞碎片，中间为DNA，上层为RNA产

物；

6． 吸取上层液相RNA提取液，置另一个EP管中（小心勿吸到沉淀，约为250~300ul）； 7． 每管加入异丙醇300ul（V异丙醇：VTRIZOL=1:2）（异丙醇为有机溶剂，根据相似相溶原理，

RNA不溶于其中，其他杂质溶于其中）； 8． 上下颠倒，轻轻混匀，室温下静置10分钟； 9． 4℃，12000×g，离心10分钟，弃上清； 10． 用800ul 75%乙醇（用1‰DEPC处理水配制）洗沉淀，振荡器振荡15秒钟； 11． 4℃，12000×g，离心5分钟，弃上清（挥发乙醇2分钟）

TRIzol法同时提取RNA,DNA,蛋白质

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\\DNA\\蛋白质．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切

提取RNA中所用各种试剂的作用：

1、氯仿：

氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA 的亲水基团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。

氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通 过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提 完之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提 掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用

通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作。 2、

异丙醇：异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受

哺乳动物组织样品RNA的抽提

哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

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哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。 一、实验材料：

Trizol试剂（Invitrogen公司）

研钵，匀浆器，镊子，铝箔都高温灭菌即可； 二、具体过程：

1、样品在离体后应迅速冷冻在液氮中，若是比较大块的组织，要尽量把组织剪切成黄豆大小的块，使液氮迅速渗透到组织内部而防止组织内部的RNA降解。组织用铝箔包好或放入冻存管中，并做好记号，注意不要把记号写在纸上，以防纸被组织的血水渗透而导致记号模糊。可以把铝箔放入纱布袋并储存在液氮中。

2、在抽提RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷。从液氮罐中取出样本后，把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干。一次研磨的组织块重量不要超过300mg。

3、研磨到组织样品成粉末状后

1. 组织样品：称取 20mg-50mg 样品，使用液氮研磨或者匀浆器匀浆，加入 RNA-Solv ? Reagent裂解

2. 室温静置 2-3 分钟。

3. 加入 200μl 氯仿(氯仿的使用量为 1/5 RNA-Solv ? Reagent 的使用量） ，涡旋混匀 15 秒，冰浴 10 分钟。

4. 4℃，12,000×g 离心 15min。

5. 小心转移不大于 80%的水相层至新的离心管，加入 1/3 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀 15 秒。

6. 将 HiBind RNA 结合柱套在 2ml 离心管中， 转移不大于 700μl 混合液至 HiBind RNA 结合柱中。

室温下 10,000×g 离心 1 分钟，弃滤液。

7. 重复步骤六，直至所有的混合液全部离心，结合到 HiBind RNA 结合柱上。

8. 将 HiBind RNA 结合柱套在新的 2ml 离心管中， 加300μl RNA Wash Buffer I 至 HiBind RNA 结合柱中，10,000×g 离心 1 分钟，弃滤液； 9. （选做）DNase I 消化:

a. 配制 DNase I(Digestion Buffer, 73.5μl; RNase-Fr

RNA提取标准流程

原理：

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol使样品细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。

预防RNase污染注意事项：

1． 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。 2． 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

3． RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高压灭菌，然后烘干即可。

4． 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.05% v/v，充分混匀后37oC放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）

RNA的提取

准备试剂：氯仿，异丙醇（可保存在-20oC，用时取出置于冰上），75%乙醇，无RNase的水。所有.溶液均需用0.05% DEPC处理过的水配制。10×Loading buffer（宝生物工程（大连）有限公司，货号：D603，35元，1mL×5支）

准备器材：1 mL、200 μL枪头、小烧杯*3、1.5 mL Epp

RNA纯化作为分子生物学实验的起始实验由于其繁杂的抽提过程且稍不注意样品容易被RNA酶降一直困扰着诸多的科研人员。针对于不同的样本应该采取不同的处理方法和抽提方式。细胞样品是几类样本当中最容易抽提的样本，裂解充分且不易降解；动物组织则相对较难，一是样本容易从活体脱离之后容易被降解，第二是有一些样本不容易打碎裂解，比如骨组织、肌肉组织等；而植物组织抽提RNA最常见的是杂质多。本文从采集样品开始来一一解决您RNA纯化过程中的难题。

一、抽提RNA的目的及各实验对RNA抽提样本的要求：

1、cDNA文库、芯片实验要求RNA完整性而无酶反应抑制物残留； 2、Northern对RNA的完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低； 3、RT实验堆RNA完整性要求不高，但RACE实验除外，但由于通常下游做PCR实验，所以对酶反应抑制物要求较高。

二、各样品中RNA的含量

高丰度（2-4ug/mg）：肝脏、胰脏、心脏

中丰度（0.05-2 ug/mg）：脑、胚胎、肾脏、肺、胸腺、卵巢 低丰度（＜0.05 ug/mg）：膀胱、骨、脂肪

三、样品的采集与保存

在样品离开活体之后或者离开了原来的生长环境，内源性的RNA酶释放出来会马上降解RNA，降解的

CTAB方法提取RNA

叶片RNA的提取

（1）取叶片材料两克，液氮中研磨成细粉末。

（2）每管加入10ml65℃预热的CTAB提取液和500 l β-巯基乙醇，剧烈涡旋匀浆，65℃水浴温育30min。

（3）每管加入10ml氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴10min。4℃，12000rpm离心10min。

（4）取上清，加入1∕3体积的8M LiCl和500 l β-巯基乙醇，-20℃沉淀过夜。

（5）4℃，12000rpm离心20min。

（6） 弃上清，沉淀用4ml异硫氰酸胍变性液溶解，加入120 l β-巯基乙醇和880 l 2M Na Ac (pH4.0),混匀后加入5ml的酚：氯仿：异戊醇（25：24：

1）， 涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（7）取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（8）取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（9）取上清，加入1∕10体积的3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置过夜。

（10）4℃，14000rpm离心