引物二聚体形成原理

什么是引物二聚体？怎样消除引物二聚体?

是引物的3'端间相互错配扩增形成的。引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们 的肉眼看不到而已。提高PCR严谨性(包括提高退火温度，降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度。

减少PCR产物中引物二聚体的方法:

1从引物自身 着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法; 2.可能模板有问题;模板浓度过小，适当加大模板量;

3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可 降低它们的浓度; 4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引 物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。

5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可 以增强特异性;

6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ

两种定量检测D-二聚体方法的探讨

摘要】目的探讨两种定量方法检测同一标本D-聚体之间的结果比较。方法分别用胶体金免疫渗透法和全自动血凝仪上使用的免疫比浊法检测180例门诊及住院病人标本。结果免疫比浊法测定结果阳性率高于胶体金免疫渗透法。结论 D-二聚体的多种检测方法中，胶体金免疫渗透试验和全自动血凝仪上使用的免疫比浊法都拥有能定量检测、快速、简单、敏感性高等优点，但全自动血凝仪上使用的免疫比浊法相对于胶体金免疫渗透法，易在大多数医院推广使用，有很好的应用前景。

【关键词】 D-二聚体定量检测胶体金免疫渗透法免疫比浊法

【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）31-0138-02

随着心脑血管及其他器官血栓性疾病对人们生命威胁的日益加重，医学界对血栓性疾病的研究越来越深入。D-二聚体是交联的纤维蛋白的降解产物，血浆内D-二聚体浓度能够反映体内继发纤溶水平。当体内发生血栓，如深静脉血栓（DVT）、肺栓塞（PE）和弥散性血管内凝血(DIC)时，纤溶酶被激活，大量交联的纤维蛋白在纤溶酶的作用下分解并释放

D-二聚体(D-Dimer)测定

1 测定方法

颗粒增强的免疫比浊法。 2 测定原理

标本中的D-二聚体(D-Dimer)与试剂中包被有抗D-二聚体抗体的胶乳颗粒相遇，发生特异性的抗原-抗体反应，形成抗原-抗体复合物，使溶液的浊度发生改变。该浊度的高低在一定抗体存在时与抗原的含量成正比，待反应完成后测定其浊度，从而使D-二聚体得以测定。 3 标本

枸橼酸盐抗凝血浆, 处理方法见标本处理程序。

稳定性：20 - 25℃ 8小时 4 - 8℃ 4天

-20℃ 6个月

其他：冰冻标本要在37℃温箱中完全溶解，再在室温重稳定15分钟后才能使用。

标本不需要稀释。

混匀标本要避免形成泡沫，标本要在2500g至少离心15分钟。

4 试剂 4.1 试剂

来源：ROCHE配套试剂（详见试剂说明书）。

贮存条件及稳定性：未打开试剂盒：2－8℃储存至效期末

R1：打开后机上稳定28天 R2：打开后机上稳定28天

准备：R1:直接使用。

R2直接使用，但是第一次使用和上机后每周要混匀一次。

其他：将R1和R2试剂放入37℃温箱中温育，并且在室温重稳定30分钟，然后

shRNA原理

shRNA 克隆原理及引物设计

一．DNAoligo设计

1.来源：1）文献报道（优先考虑）

2）网站

利用网站提供的软件设计DNAoligo：

主要使用网站有3个, 老师认为不同算法得到重合的序列比较可靠, 故三者应综合使用 网站:

举例：HEXIM1shRNA设计

A: siDirect

输入accession number, 点”retrieve sequence”, 得到完整序列. 或直接输入序列

shRNA原理

设置只要将"contiguous sequences to avoid-A's or T's" 选上, 如图下

点design siRNA

结果: 页面一次只显示100个碱基(如1-100), 需要点击所需段来查看

优先选择“Effective, Both strand”, 但“Effective, Plus strand”也可用 显示的序列23个碱基, 应去头尾各2个, 取中间19位碱基

shRNA原理

B: Dharmacon

输入accession number, step 4中选blast, database选human 点”design siRNAs”

shRNA原理

结果: 优先选择score高, mismatc

LAMP原理及引物设计与实例 ．LAMP引物的设计

LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。

FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。

F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。

BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.

B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。

2．扩增原理

60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。

shRNA 克隆原理及引物设计

一．DNAoligo设计

1.来源：1）文献报道（优先考虑）

2）网站

利用网站提供的软件设计DNAoligo：

主要使用网站有3个, 老师认为不同算法得到重合的序列比较可靠, 故三者应综合使用 网站:

http://genomics.jp/sidirect/

http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx

http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html 举例：HEXIM1shRNA设计

A: siDirect

输入accession number, 点”retrieve sequence”, 得到完整序列. 或直接输入序列

设置只要将\选上, 如图下

点design siRNA

结果: 页面一次只显示100个碱基(如1-100), 需要点击所需段来查看

优先选择“Effective, Both strand”, 但“Effective, Plus strand”也可用 显示的序列23个碱基, 应去头尾各2个, 取中间19位碱基

点击各个按钮查看各段碱基 orf

shRNA原理

shRNA 克隆原理及引物设计

一．DNAoligo设计

1.来源：1）文献报道（优先考虑）

2）网站

利用网站提供的软件设计DNAoligo：

主要使用网站有3个, 老师认为不同算法得到重合的序列比较可靠, 故三者应综合使用 网站:

举例：HEXIM1shRNA设计

A: siDirect

输入accession number, 点”retrieve sequence”, 得到完整序列. 或直接输入序列

shRNA原理

设置只要将"contiguous sequences to avoid-A's or T's" 选上, 如图下

点design siRNA

结果: 页面一次只显示100个碱基(如1-100), 需要点击所需段来查看

优先选择“Effective, Both strand”, 但“Effective, Plus strand”也可用 显示的序列23个碱基, 应去头尾各2个, 取中间19位碱基

shRNA原理

B: Dharmacon

输入accession number, step 4中选blast, database选human 点”design siRNAs”

shRNA原理

结果: 优先选择score高, mismatc

目的探讨分析急性脑梗死患者血清中同型半胱氨酸、C反应蛋白及D二聚体与急性脑梗死发生的关系。方法对本院2010～2011年收治的60例急性脑梗死患者(观察组)和60例健康志愿者(对照组)的血清中同型半胱氨酸、C反应蛋白及D二聚体的含量进行分析比较,并对患者美国卫生研究院卒中量表评分进行分析。结果观察组患者血清中同型半胱氨酸、C反应蛋白及D二聚体的含量显著高于对照组,两

22 3第9第期 0年月 1 7 1卷

临床研究

急性脑梗死患者同型半胱氨酸、 c反应蛋白及 D二聚体的变化研究丁彦博

河南省南阳市中心医院神经内科，河南南阳

4 30 70 0

【要】摘目的探讨分析急性脑梗死患者血清中同型半胱氨酸、应蛋白及 D二聚体与急性脑梗死发生的关系。方 C反法对本院 2 1~ 0 1年收治的 6 0021 0例急性脑梗死患者 (察组 ) 6观和 0例健康志愿者 (照组 )对的血清中同型半胱氨酸、 C反应蛋白及 D二聚体的含量进行分析比较，并对患者美国卫生研究院卒中量表评分进行分析。结果观察组患

者血清中同型半胱氨酸、 C反应蛋白及 D二聚体的含量显著高于对照组，组比较差异具有统计学意义 (两 P<00 ) .5: 其中观察组患者中大面积脑梗死组 ( B组 )者血

microRNA（miRNA）引物设计及过程原理说明

microRNAs的平均长度23nt左右，所以miRNA引物设计与常规引物设计存在很大差别，以下讲解一下整个miRNA引物设计的过程加上实验流程，以帮助大家对各方面的学习。

首先，引物设计之前先介绍miRNA反转录合成cDNA的过程。 我们拿经典颈环序列

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC作介绍。打开DNAstar软件的PrimerSelect；file打开下拉菜单；打开Enter New Primer…；粘贴颈环序列；点击OK。

颈环结构已经输入，下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。 选择颈环结构（鼠标点一下）；点击Report下拉菜单；选择Primer Hairpins。

第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-20.4kc/m)。 下面结合has-miR-122-5P合成cDNA的具体过程讲解has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU 将U转T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT

miRNAs的颈环结构引物：是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3

慢性肝病患者血浆纤维蛋白产物、抗凝血酶III及D―二聚体

的临床研究

摘要：目的 检测慢性肝病患者的血浆纤维蛋白降解产物（FDP）、抗凝血酶-III（AT-III）以及D-二聚体（D-D）的水平，探讨其变化的临床意义。方法 随机选取我院近年来收治入院的30例慢性肝炎、30例肝硬化以及30例正常体检人员作为研究对象，分别检测其血浆纤维蛋白降解产物、抗凝血酶-III以及D-二聚体水平加以对比分析。结果 三组患者在各项相关指标上均存在显著的差异，P<0.05，有统计学意义。结论 通过对血浆纤维蛋白降解产物、抗凝血酶-III以及D-二聚体水平的检测，可有效判断慢性肝病患者疾病的严重程度，为疾病的诊断以及治疗提供可靠的依据。

关键词：慢性肝炎；肝硬化；血浆纤维蛋白降解产物；抗凝血酶-III；D-二聚体

机体的正常代谢主要依靠肝脏完成，人体内多数的纤溶和抗纤溶因子以及凝血和抗凝血因子均由肝脏产生。慢性肝病发生时，肝脏的代谢功能紊乱，呈现出不同程度的纤溶系统以及凝血系统障碍[1]。本文为了探讨慢性肝病患者纤维蛋白降解产物、抗凝血酶-III以及D-二聚体变化的临床意义，现从我院随机选取慢性肝炎、肝硬化以及正常体检人员各30

例作为研究对象，分别对其进行检测加以对比分析。具体结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本次研究所选研究对象为我院近年来收治入院的30例慢性肝炎患者、30例肝硬化患者以及30例在