蛋白质凝胶电泳实验报告

重庆大学研究生专业实验教学

实验报告书

实验课程名称： 实验指导教师： 学 院： 专业及类别： 学 号： 姓 名： 实验日期： 成 绩：

凝胶电泳实验

生物学

重庆大学研究生院制

一、实验目的

1.理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本原理。 2.熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作。

3.通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免。

4.利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、浓度和分子量以及分离大小不同的DNA片段。

5.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定DNA和蛋白分子量大小的方法。 二、实验材料、用具及试剂

1.材料：菌落PCR产物（待检测DNA片段）；

2.用具：①琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，水平板型电泳槽，电子天平，微量移液器

（10μl），枪头，三角瓶，点样板，梳子，微波炉，凝胶成像仪；

②聚丙烯酰胺凝胶电泳：垂直板电泳槽，稳压稳流电泳仪，梳子；

3.试剂：琼脂糖，1×TAE缓冲液，载样缓冲液（Loading buffer），goldviwe染料，

DL5,000 DNA Marker (Takara)。

三、实验原理

核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴

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凝胶电泳实验

生物学

重庆大学研究生院制

一、实验目的

1.理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本原理。 2.熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作。

3.通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免。

4.利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、浓度和分子量以及分离大小不同的DNA片段。

5.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定DNA和蛋白分子量大小的方法。 二、实验材料、用具及试剂

1.材料：菌落PCR产物（待检测DNA片段）；

2.用具：①琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，水平板型电泳槽，电子天平，微量移液器

（10μl），枪头，三角瓶，点样板，梳子，微波炉，凝胶成像仪；

②聚丙烯酰胺凝胶电泳：垂直板电泳槽，稳压稳流电泳仪，梳子；

3.试剂：琼脂糖，1×TAE缓冲液，载样缓冲液（Loading buffer），goldviwe染料，

DL5,000 DNA Marker (Takara)。

三、实验原理

核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴

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实验课程名称： 实验指导教师： 学 院： 专业及类别： 学 号： 姓 名： 实验日期： 成 绩：

凝胶电泳实验

生物学

重庆大学研究生院制

一、实验目的

1.理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本原理。 2.熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作。

3.通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免。

4.利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、浓度和分子量以及分离大小不同的DNA片段。

5.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定DNA和蛋白分子量大小的方法。 二、实验材料、用具及试剂

1.材料：菌落PCR产物（待检测DNA片段）；

2.用具：①琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，水平板型电泳槽，电子天平，微量移液器

（10μl），枪头，三角瓶，点样板，梳子，微波炉，凝胶成像仪；

②聚丙烯酰胺凝胶电泳：垂直板电泳槽，稳压稳流电泳仪，梳子；

3.试剂：琼脂糖，1×TAE缓冲液，载样缓冲液（Loading buffer），goldviwe染料，

DL5,000 DNA Marker (Takara)。

三、实验原理

核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴

重庆大学研究生专业实验教学

实验报告书

实验课程名称： 实验指导教师： 学 院： 专业及类别： 学 号： 姓 名： 实验日期： 成 绩：

凝胶电泳实验

生物学

重庆大学研究生院制

一、实验目的

1.理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本原理。 2.熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作。

3.通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免。

4.利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、浓度和分子量以及分离大小不同的DNA片段。

5.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定DNA和蛋白分子量大小的方法。 二、实验材料、用具及试剂

1.材料：菌落PCR产物（待检测DNA片段）；

2.用具：①琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，水平板型电泳槽，电子天平，微量移液器

（10μl），枪头，三角瓶，点样板，梳子，微波炉，凝胶成像仪；

②聚丙烯酰胺凝胶电泳：垂直板电泳槽，稳压稳流电泳仪，梳子；

3.试剂：琼脂糖，1×TAE缓冲液，载样缓冲液（Loading buffer），goldviwe染料，

DL5,000 DNA Marker (Takara)。

三、实验原理

核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴

实验一：琼脂糖凝胶电泳对DNA提取

实验目的：学习使用水平式琼脂糖凝胶电泳进行DNA的提取。

实验原理：琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用生物染料嵌入DNA分子后在紫外下显色。

1）在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。由于糖——磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

2）在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量和不同构型的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

3）生物染料在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，生物染料从正极向负极移动，就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在生物染料足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。

实验材料：微量移液器(2μl和4μl)，高压灭菌锅，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置，微波炉等。TAE电泳缓冲液，琼脂糖凝胶，PCR 扩增样品

蛋白质双向电泳实验流程

一．样品制备 1.研磨

研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。

2.加入8mLTris饱和酚（pH8.8）和8mL抽提液，在通风橱内研磨30s。 先加8mLTris饱和酚，Tris饱和酚会变成固体，此时需用研磨碓将固体的Tris饱和酚研磨成小块。接着加入8mL抽提液，也需将固体的抽提液研磨成小块。等三者混匀后，将粉末转移至45 mL tube。

3.振荡30min。

室温静置，待tube中固体变成液体后，开始振荡。振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。

4.10000g，4℃，10min。将酚相（top phase）转移至45mL tube。酚相（top phase）可置于冰上。

酚相应该是绿色的，水相应该是淡黄色的。

5.取6mL的抽提液和6mL饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。 振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。

6.10000g，4℃，10min。将酚相（top phase）转移至45mL tube。

7.沉淀酚相。取一定体积（是酚相的5倍）的0.1M乙酸铵/甲醇溶液（–20℃保存）于酚相（45mL tube）。振荡30s，

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聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质

【目的】

1 ．掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。

2 ．熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

【原理】

带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂过硫酸铵（ Ap ）和加速剂四甲基乙二胺（ TEMED ）的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。

聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章），使样品分离效果好，分辨率较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条

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聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质

【目的】

1 ．掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。

2 ．熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

【原理】

带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂过硫酸铵（ Ap ）和加速剂四甲基乙二胺（ TEMED ）的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。

聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章），使样品分离效果好，分辨率较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条

实验五 SDS-PAGE蛋白质电泳 蛋白质电泳 准备实验----------溶液的配置 溶液的配置

实验内容

一、变性蛋白质电泳系列溶液1、单体母液 (1,4,8组) 、 50 ml 组 15.00 g 丙烯酰胺 0.40 g 甲叉双丙烯酰胺 去离子水定容至50 ml ,定性中速滤纸过滤，棕 去离子水定容至 定性中速滤纸过滤， 定性中速滤纸过滤 色试剂 瓶4℃存放。 ℃存放。 2、 10% (w/v) SDS (2,4,9组) 10ml 、 % 组 SDS 1.0 g 10 ml 去离子水

3、分离胶缓冲液(4×,pH=8.80,50 ml)( 、分离胶缓冲液( × )(1,7,8组) , )( 组 Tris-Base(1.5 mol/L) 9.08 g 10%(w/v)SDS 2 ml % 用30ml去离子水溶解，再用浓HCl调节 到8.8,过 去离子水溶解，再用浓 调节pH到 ， 去离子水溶解 调节 定容到50ml,4℃存放。 滤，定容到 ℃存放。 4、浓缩胶缓冲液(4× ,pH=6.80,50 ml )( 、浓缩胶缓冲液( × )(3,5,10组) , 组 Tris-Base(0.50 mol/L) 3

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

凝胶层析法分离纯化蛋白质

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

【目的】掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验 技能

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

凝胶过滤层析凝胶层析是按照蛋

白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。

单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

带网孔的 葡聚糖珠小分子进入 葡聚糖珠内

大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出

凝胶过滤层析过程示意图

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

凝胶 珠

凝胶基质

小分子 大分子

凝胶过滤层析过程示意图

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

总结：相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒